推 HEK293:先用水當control確定沒污染再說。 02/21 18:26
有試過
我是這樣配置
1.negative controll(不應該有band) ----> dna+ez+.... --> pcr
2. ----> dna+water ---> pcr
3. -----> water
前兩組用的DNA一樣，都是不應該被PRIMER黏上的TEMPLATE
結果是有加enzyne的，做完pcr 有band -------> 不應該有
沒加enzyme是完全沒東西 -------> 正常
所以感覺就是primer不知為啥會黏出東西
可能是tm值問題
但tm值目前是不可能變動，不然實驗組也弄不出來
control條件又需和實驗組一樣，不然不叫control組
所以才想知道有無辦法知啥情況下，本應不該黏上的卻可以黏上
這樣就可以把control去掉
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 11:34)
→ Ianthegood:pcr原理自己複習一下吧 有聽過non-specific binding嗎 02/22 13:32
所以我才想要知道在怎樣的條件下
才會產生這種不該BIND卻BIND上去，而做出產物的情況
我想知道那個CONDITION，比如TM值，或是其他東西
(而我希望有軟體或是更精準的實驗方法告訴我
因為目前為止，同樣的sample同樣的condition卻會出現前一次有東西後一次沒東西
表示非常不穩定，所以我沒辦法藉由比如
45c --> 沒band
44c --> 有band
43c --> 有band
來推測 44度c或許是該值
ps:現在實驗情況是 比如
45c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
44c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
43c ----> 第一次 沒band ------>第2次 有band ------> .....
.....
...
..
而實驗組condition剛好落在中間
以目前比較合理的猜測即是TM值太低
加上PRIMER專一性低
即是Ia大講的部份
所以我才想要找出那個值，或是該問題
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 17:07)
補充一下
我的想法是這樣
今天比較合理的假設就是不專一
(TM值太低；PRIMER專一性不夠；....等等)
但我要先有東西證明
的確今天是因為這樣問題才會有BAND
而不是其他我沒注意
或是我沒辦法排除的因素造成這個東西出現
這樣我才有辦法在實驗中把這項污染去掉
感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 59.126.67.149 (02/22 17:11)
推 aceliang:為什麼沒有water當template的control................... 02/22 20:17
上面有提到
有單只跑 DNA+水 跟 單只 水 這兩組
而這兩組都沒事
推 icome:先確定是不是汙染吧 之前發生過pipetman汙染怎麼P都有band 02/22 22:07
我同一次操作
一次做兩組 (同樣東西)
分兩次pcr
同台機器，而且聽從同學意見，連pcr機裡放的well都一樣
前次跟後次就是不一樣
→ icome:template來源是否乾淨? 再者慢慢提高Ta就可以找到條件 02/22 22:09
→ icome:如果是pepetman汙染通常還會交叉汙染 連你的sample也會汙染 02/22 22:12
→ icome:汙染源通常是 吸過高濃度的目標基因 例如plasmid 02/22 22:13
→ satasumi:使用的PCR機器是不是同一台? 02/22 23:52
如果是ez buff dna water .... 等等汙染的話
應該沒道理
同樣實驗同樣操作
前次有汙染，後面卻沒汙染
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/23 00:04)
感謝上面各位大大
幫我想辦法
小弟在這邊先謝過
萬分感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/23 00:07)
推 HEK293:那個水control的意思應該是要水+primer set+enzyme吧... 02/23 09:09
→ HEK293:用non-targeted DNA做NC太容易有意外。 02/23 09:10
做這目的應該是
1.汙染來自dna ---->則用水取代dna時 就不會有band出現
(當然前題是我要先確定此dna跟PRIMER的確是不MATCH的，同時還需
另一組乾淨dna做check)
2.汙染來自水 ----> 則用水取代dna 卻還是有band出現
我上面有提到我有做一組
dna+水 下去跑pcr當control ------> 沒band出現
所以有可能為:
1.水跟dna沒汙染
2.或是有污染但因為沒ez，primer...等等把他放大
接著看我平常實驗的CONTROL
dna+water+ez+primer.....等等
卻會有前次有污染，後次卻沒汙染的情況
所以會變成為
1.如果是 這些內容有污染，在每次都有混勻的情況下取樣，應該結果都是一樣
要馬都污染，要馬都沒污染
(我知道如果直接跑一管以水取代DNA，仍加PRINER，EZ會比較直觀
但就現有資訊應該也可以得證 ?)
→ Ianthegood:我覺得是sample交叉污染 給其他人做幾次看看 02/23 11:49
交叉污染的意思是比如a管dna污染到b管dna嗎?
可現在CONTROL組跑出的BAND大小跟實驗組不太一樣 差了約200bp
而且主要在於汙染應該是不可逆的
也就是污染了就污染了 (除非他degray)
這樣就無法解釋 為甚麼同樣實驗 多次實驗下來 前後結果會不一樣
另外想請問HEK大大
你提到 "用non-targeted DNA做NC太容易有意外。"
因為小弟實驗目前是這樣
有組DNA叫 RV
我將這DNA拿去做bisuilfite處理
(DNA序列上的 C會轉變為T (U)， 但如果這C上有被甲基化，則依然保持C)
暫稱 RV(B)
因應序列前後的改變 ( RV----->RV(B) )
我設計了一組 "序列改變後"的primer
也就是理論上他只會和 bisulfite處理過後的DNA進行binding
RV(B)
此時我設計了兩組control
pos+ control:
利用另外一組PCR primer從RV上P出一段DNA
因應PCR product "不會" 有甲基化的情況
因此把這段P出來的DNA進行bisulfite處理
則此DNA序列上的C 必然 會轉變為 T(U)
(此處排除轉變不完全因素，有別組control來排除這因素)
(PS 這邊使用的PRIMER和實驗組 primer不同，這邊的primer match的是
非bisulfite的序列，單純用來做出一段沒有甲基化，且包括我感興趣片段的
DNA片段)
所以利用這組當POS control
也就是假設我的實驗組中
的確有這片段，同時處理bisulfite成功，則band size應該會和 +control一樣
(確認DNA中是否有這片段還有另一步驟duoble check
bisulfite處理成功 也還有另一步驟duoble check)
NEG- control:
拿原始RV DNA做為control
也就是處理bisulfite使他序列改變"前"的DNA
因應primer設計是以 "處理過後" 的DNA序列
= RV(B)
因此RV理論上是不可能被binding
目前我是這樣設計的
但HEK大大提到的我剛剛有想了一下
的確non-target negative control有很多問題
我自己想到的有這些
1.沒BAND不一定就等於 他不會bind
2.-control 有BAND也不代表 實驗組的BAND是錯的
想請問HEK大大有沒有比較好的方法可以提供給小弟
萬分感謝
也非常謝謝其他大大
真的非常感謝
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:44)
→ whalepipi:推HEK293，水control請加enzyme先試試，再去考慮其他 02/23 13:06
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:47)
※ 編輯: travelmat 來自: 140.120.130.105 (02/23 13:54)
推 aceliang:考慮很仔細很棒，但是既然在troubleshooting，應該以排除 02/23 23:39
→ aceliang:為先。當然如果這是你的研究主題，那無妨。 02/23 23:40
→ aceliang:non-targeted control就像scramble RNAi一樣很難設計， 02/23 23:41
→ aceliang:更何況你的理論neg cont.序列相似度頗高+Tm低。 02/23 23:42
謝謝樓上各位
我決定重頭再一次把SMAPLE ，水...等等全部check一次
(其實已經check過兩次了= =)
先排除污染
如果不行的話接著在考慮 non-target control 這部份
@ace大
很不幸的這步只是我實驗的第二步....
後面還有更麻煩的>"<
當初有考量到兩段序列 (即處理前跟處理後的序列) 非常相近
即使bind的位置有特別選過，但又加上tm值問題
會出現這情況似乎也是可預期的
但目前實在想不到其他方法可以替代
加上自己實驗室跟周圍實驗室沒人用類似方法做此類實驗
無從問起
paper在這部份又會忽略
加上現在paper都用kit做這種實驗= =
所以只能自己一步一步try
真的非常感謝各位大大
祝各位實驗順利 :)
※ 編輯: travelmat 來自: 114.33.54.112 (02/25 10:50)