[求救] 用kit抽plasmids

[mkmai0802 (Wengda)]

各位大大您好

小弟最近將一個基因接到一個plasmid載體上後 !

轉型到DH5-alpha內, 塗盤挑single colony !

再O/N培養, 之後取 2.5 ml 的菌液用kit抽plasmids ~

用廠商的elution buffer回溶 100 ul ! 也用這 elution buffer 當Blank !

測出來的濃度約是50-100 ng/ul ,

之後再分四管 ,  每管約150ng plasmids

(1) 用EcoRI+HindIII切兩刀
(2) 用EcoRI切一刀
(3) 用HindIII切一刀
(4) 都沒切

            再去跑1%的Agarose gel !

問題來了 第1-3的位置都比 4的位置(下面)小一點

因為切開了 所以長度比較正確 ! (這應該沒問題)

問題在於1 , 一沒有出現 我想要的band !

老師說可能是我算錯濃度 ! 濃度太高 所以切不動 = = !

所以想問問 抽出來的plasmids 這樣的濃度合理嗎 ?

他叫我 要放到 3-4 ug ! 可是我抽出來的量 沒那麼多啊 ><



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我愛妳 用生命的愛 ~


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 203.64.80.74
推 iamwi:會不會很衰的是兩個質體互相接起來了~因為沒看到做AP或CIP
推 TAKONA:plasmid size正確嗎？你定序過確定裡頭有insert？
推 dodomilk:問題同二樓，你有作colony PCR看有沒有接近去嗎？
→ dodomilk:你們老師應該沒做過實驗吧...這兩個RE隨便切都切一大堆
推 tsubasawolfy:理論上高度 2=3>4>1才對吧 1=2=3?
推 tsubasawolfy:用ta系統照廠商條件做很難失敗 該不會你只挑1顆?
推 huuban:2跟3的位置一樣嗎
推 Realthugz:怎麼可能... 你是用口水切嗎 單位ug都照切好嗎...
→ Realthugz:plasmid拿去PCR一下 夾出你的片段 準確又省DNA