Re: [求救] 用kit抽plasmids

[mkmai0802 (Wengda)]

※ 引述《mkmai0802 (Wengda)》之銘言：
: 各位大大您好
: 小弟最近將一個基因接到一個plasmid載體上後 !
: 轉型到DH5-alpha內, 塗盤挑single colony !
: 再O/N培養, 之後取 2.5 ml 的菌液用kit抽plasmids ~
: 用廠商的elution buffer回溶 100 ul ! 也用這 elution buffer 當Blank !
: 測出來的濃度約是50-100 ng/ul ,
: 之後再分四管 ,  每管約150ng plasmids
: (1) 用EcoRI+HindIII切兩刀
: (2) 用EcoRI切一刀
: (3) 用HindIII切一刀
: (4) 都沒切
:             再去跑1%的Agarose gel !
: 問題來了 第1-3的位置都比 4的位置(下面)小一點
: 因為切開了 所以長度比較正確 ! (這應該沒問題)
: 問題在於1 , 一沒有出現 我想要的band !
: 老師說可能是我算錯濃度 ! 濃度太高 所以切不動 = = !
: 所以想問問 抽出來的plasmids 這樣的濃度合理嗎 ?
: 他叫我 要放到 3-4 ug ! 可是我抽出來的量 沒那麼多啊 ><

針對大大的問題 我在寫詳細一點好了 !

我那個gene的cDNA有再用他Start codon 和 stop codon地方再設計一組primer !
頭加上EcoRI的切位,尾加上HindIII的切位 !
用Taq加上有proofreading的polymerase 10:1的量去PCR !
跑膠 也確實有約3K的band ! (我的基因cDNA約3K)
之後 利用 invitrogen TOPO PCR 2.1 的 TA vector接上 !
就大約會產上約 7K的 plasmids !
然後transform到DH5-alpha內
這時候有用cDNA的primer去做colony PCR !
確實有很強的band ! (做兩次 一組用約500bp 另一組用全長去PCR)
確定有後 我挑single colony去O/N !
再抽plasmids !

可是要切的時候就發生一些問題 !!
所以想先請問大大 ~
我的plasmids 濃度合理嗎 ? 太稀嗎 ?
還想請問大大 !
跑膠要有band 大概要放多少ng的plasmids !
按照我濃度算出來 我100ng 就有band了(還蠻強的) !
我們老師說不可能 ! 要放到 1-5個ug !?
所以我懷疑我濃度有問題 >"<

我的RE是用 Biolabs EcoRI-HF HindIII-HF

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我愛妳 用生命的愛 ~


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 203.64.80.74
推 mesenchymal:濃度50-100 ng/ul差不多
推 mesenchymal:至於用跑膠粗估濃度的話,就對照marker的band亮度比吧
→ mesenchymal:例如 http://ppt.cc/P3j8
→ mesenchymal:可以的話可以放上跑膠圖給大家看看狀況?
→ blence:理論上第2,3組應該比4還高,你卻看到相反的結果,想必你忽略
→ blence:pCR2.1上也各有EcoRI及HindIII切點,才導致1,2,3組結果相同
推 jabari:同樓上pcr2.1ta接位往前往後6bp就是EcoR1切位
推 jabari:另外w-digestion的buffer正確嗎??改用序列切割呢??
推 dodomilk:請問你跑(1)(2)(3)(4)的gel有對照marker看嗎？
→ dodomilk:理論上(1)和(2)(3)的pattern應該完全不同喔！
推 icome:跑膠極限大概10ng 100ng很OK啊..
→ Realthugz:你知道一般marker最亮那條也才幾十ng/ul左右而已嗎
→ Realthugz:RE跑膠 PCR跑膠 放大絕====>定序
推 qiet:妳們老師在搞笑吧 到ug基本上都超亮 但妳放的濃度應該也OK
→ lail:其實我覺得作TA很容易發生怪事(自己的經驗).TA是我的最後選擇
推 joseph103331:如果你是用150ng的plasmid去跑 那你的片段切下來大約
→ joseph103331:只有其中的3/7 也就是約64ng 可以考慮切久一點?
→ jimmyshen17:跑膠100ng很夠了~~RE切多久阿??