[求救] 跑PI時出現奇怪的圖形(已解決)

[gqqueen (夠幸福了)]

今天跑PI時，如往常般的處理細胞(70%酒精 over night)及染色，

以往在DMSO control皆會有G1.S.G2/M明顯的peak，但今天要在重複實驗時，

卻在FL2A-counts圖只出現一個山丘狀的圖形也很不sharp，完全沒有其他的Peak產生

而在FSC/SSC圖細胞也不是均勻散布，反而有點橢圓形緻密，然後在FL2-A/FL2-W

也沒出現正常的圖形，反而是一條長長的細胞帶狀圖，調了很多次數值也一樣，

叫出以前同樣細胞同樣處理的condition也是找不出問題

想請教版上的專家，有在跑PI時碰過類似的情況嗎？

細胞的處理:藥物處理 24 48 72小時
           Control:DMSO

細胞打下來前都有先觀察，和先前的實驗差不多，這是reapeat實驗

先謝謝大家的幫忙了

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.117.13.40
※ 編輯: gqqueen         來自: 122.117.13.40        (02/28 02:20)
推 FireHell:參數跑掉了
→ gqqueen:可以請F大再詳細說明嗎 不懂參數跑掉指哪一個?
推 FireHell:FSC, SSC, FL2, FL2-A, FL2-W這些參數的Voltage和amp
→ FireHell:要調一下
→ FireHell:另外橢圓形和帶狀都是正常的耶
推 qiet:flow cytometry有受過什麼調整過嗎?
→ qiet:有的話參數要重抓 但如果機器都正常...可能要想別的原因
→ gqqueen:隔天我有先拿別株細胞測試是不是reagent出問題，跑完之後
→ gqqueen:都是對的，所以我馬上拿我有問題的sample從新跑一遍，
→ gqqueen:最後發現出現peak怪怪的只有在48.72小時，而24小時的都很
→ gqqueen:正常，所以目前把問題縮小到48,72小時細胞前處理哪個環節
→ gqqueen:但原因現在還不清楚，我唯一想的到的可能，是細胞收下來後
→ gqqueen:放在室溫一個小時，不知道是不是這樣的因素 導致MDA-MB-23
→ gqqueen:細胞出問題，才會跑出奇怪的圖形，不知道大家覺得這樣
→ gqqueen:的解釋合理嗎？這是排除人為操作，reagent，flow熟練度
→ gqqueen:唯一的可能解釋了，因為這個實驗我repeat兩次都沒問題
→ gqqueen:就在最後一次出了問題了@@"
推 qiet:細胞收下來後固定前我都會放在冰上or4度C 避免細胞產生奇怪的
→ qiet:變化
推 lyu0001:可能是同一批細胞固定染色不完全
→ FireHell:不同時間點的FSC和SSC可以參數不同，GATING範圍不同
→ FireHell:看起來比較像是細胞型態在48H後劇烈變化而沒有GATING好
→ FireHell:另外一個可能就是你的TREAT會導致S phase arrest
→ gqqueen:給Qiet 我48.72小時細胞收下來後，就擺在架子上，大約一小
→ gqqueen:時以上= = 當時後再做另一個實驗，所以就沒先處理了，下次
→ gqqueen:我會先放在冰上看看
→ gqqueen:給F大我跑PI只有gateingFL2-A/FL2-W這邊，然後我發現48小
→ gqqueen:時候的細胞，在FSC/SSC這邊有幾管出現疑似兩群不同大小的
→ gqqueen:的細胞，但他們還是有重疊，形狀類似於兔子的耳朵但有交疊
→ gqqueen:不知道這樣形容貼不貼切
→ gqqueen:48小時以後的細胞
→ gqqueen:給L大我細胞都固定至少24小時，然後染色也有兩個小時以上
→ gqqueen:避光保存，這樣還會發生染色固定不完全嗎?
推 FireHell:收細胞要快，所以放1h絕對不ok，不過會不會導致這些結果
→ FireHell:不得而知，建議下次收細胞要連續之外，可參照這篇
→ FireHell:http://0rz.tw/wAduL
→ FireHell:另外注意流速控制在LOW SPEED 100 EVENTS/SEC
→ gqqueen:謝謝F大提供這個很棒的資料，可以把參數條得更好，非常謝
→ gqqueen:謝你，這次重做我不敢再放那麼久了，本來以為不會出什麼
→ gqqueen:什麼問題，看來下次收下來前一定要先放冰上，盡快固定
※ 編輯: gqqueen         來自: 122.117.13.40        (03/02 22:19)
※ 編輯: gqqueen         來自: 122.117.13.40        (03/02 22:20)