[求救] miRNA做real-time

[aceliang (炸蝦沾釀)]

各位好，小弟最近在做miRNA的real-time，遇到點問題請教...

1. 目前我個人的作法是Total RNA抽出來(TRIZol)，取定量(約5ug)做
   polyadenylation (用polyA polymerase + ATP, NEB)，之後直接取1/10體積
   用Oligo dT轉RT (SuperScriptIII, Invitrogen)。之後產物cDNA去跑real-time
   Control都會用U6，目前為止都很穩定，但是miRNA的表現卻很跳痛。
   該高不高，該低不低，重複的樣本也會上上下下。實在很難定量分析。
   想請問有沒有更好的方法？

2. 有一說是RT用stem-loop primer去做類似RACE，會有比較高的專一性
   對於mature vs. precursor miRNA比較能做(結構上的)區分。
   不知道板上先進的建議是？

3. 目前小弟使用KAPA的2X master mix，機器是StepOne plus，
   某些target容易跑出multiple Tm peak，salesperson是給我建議說
   把reagent再稀釋些，這麼做難道還要try稀釋條件？還是有個大略值呢？

幾個問題請教，還請高手協助～喔耶～


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這個嘛...
http://aceliang.pixnet.net/album
http://www.wretch.cc/album/
http://123.342.123.321.231.321

選哪個好呢？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 220.135.72.79
推 kingbar:miRNA的precusor和mature form都沒有poly A喔~
→ kingbar:用Oligo dT當然轉不出來，好奇你real-time如何設計primer?
推 HEK293:有 polyA tailing
推 huuban:看你是要增幅mature還是precusor吧，方法不太一樣
→ huuban:很好奇你的primer是怎麼設計？
→ aceliang:目標是要做mature，所以才想說原方法可能不夠好
→ aceliang:primer有兩組抄自publication，一組用Primer express設計
推 kingbar:喔喔~不好意思，我沒看清楚原PO有做polyadenylation
→ huuban:mature用Oligo dT是做不出來的啦，mature miRNA沒有polyA
→ huuban:如果你有polyadenylation, 還是很難説
→ huuban:因為有些 miRNA 訊號真的很低，一般的方法可能會看不到
→ huuban:假使你有資料可以參考，看看他們是用什麼方式吧
→ huuban:目前我知道的也僅有 Taqman 和 LNA 兩種，抱歉孤陋寡聞 / \
→ aceliang:h大快別這麼說！您已經給小弟相當建議了！謝謝
→ aceliang:我好奇說如果我用stem-loop轉RT，那internal control要？
推 conan11:miRNA要用特別的internal control  如U6,U3
→ conan11:ABI有很多可以挑，當然也可以自己合成
推 jabari:kapa mm是sybr不飽和螢光, 可改用Evagreen 系統
→ RickyKckao:internal control 可以用snoRNA-412
→ aceliang:感謝以上各位的建議！看來我有得試了XD