[求救] 質體轉不進表現菌株~請問有什麼辦法解決

[lier1986 (紫)]

小弟我在幾個星期前有發一篇相關的文

許多版友都認為可能是我insert DNA對細菌有致死性

所以我對實驗做了兩個部分的修改

應該可以證明 並不是上述原因


第一 我用的expression host 改成用BL21(DE3)pLysS

在有IPTG誘導的情況下 insert DNA才會表現

但是 轉型後還是不長菌


第二 我將做完電穿孔的菌液 分成兩半 塗在含有不同抗生素的盤子中

BL21(DE3)pLysS自己帶有抗chloramphenicol的基因

所以長在chloramphenicol的盤子上 非常良好

但 對應plasmid的抗抗生素基因的盤子 則是一個也長不出來

表示 我的plasmid根本沒有轉進去


我用的質體是pET20b 大小是3.7K左右

加上insert DNA之後 大小約為5.5K


將pET20b轉入BL21(DE3)pLysS

只要用3ng就長很多 (此為control 代表我的competent cell是可以用的 雖然效率差了點)


但是加上insert DNA的pET20b怎麼樣都長不出來 (應該說 轉不進去

請問大家有類似的經驗嗎? 該怎麼解決呢?










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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.122.198.84
推 nhxcyge:你有確認過vector的sequence沒有錯誤嗎？ 會不會是接上
→ nhxcyge:insert的vector序列有錯，以致無法抗chloroamphenical
→ blence:樓上誤解，原po應該是說無法抗plasmid上的Amp
→ lier1986:blence沒錯
推 TAKONA:那會不會是insert沒帶stop codon做出奇怪的東西阿？
→ TAKONA:做不出你的目標蛋白和amp之類的
→ Ianthegood:ampR是獨立的gene阿
推 lyu0001:理論上DH5alpha也是可以表現出蛋白質...
推 tsubasawolfy:電不進去就是是傳統的heat shock吧 如果heat shock
→ tsubasawolfy:可以進去那就回頭檢討電的過程是那邊造成差異
→ lier1986:stop codon是在plasmid上 也沒有被限制酵素切掉
→ lier1986:所以應該不是這個問題
→ lier1986:我在想是不是因為質體大小的差異影響到轉型效率
→ lyu0001:電穿孔後，加LB medium 37degree 1hr試試看
推 micocat:我覺得你的二個修改並不能證明insert DNA對細菌沒有致死性
→ micocat:如果同時transform到BL21跟DH5alpha(or XL-blue?)
→ micocat:就可以確認是不是表現的蛋白有毒性了
推 Fourfish:DH5a轉的進去嗎? ligation後直接轉BL21效果通常很差
→ Fourfish:先轉進DH5a再抽plasmid 再轉BL21試試看吧
推 icome:試試樓上說的 而且你也不確定是不是ligation出問題
→ blence:真是鬼打牆,原po文提過是將XL-blue長好的plasmid送到BL21卻
→ blence:長不起來,如何懷疑這樣re-transform會跟ligation有關
推 dennisyoung7:掐指一算  原PO是第八個月了嗎 QQ
→ dennisyoung7:electroporation後先用LB在37C長 30~60min
→ dennisyoung7:然後離心除去大部分上清液後plate全部的細胞
→ dennisyoung7:或許有機會提高效率
→ dennisyoung7:我會想拿些plasmid跑電泳,看size跟量
→ lier1986:樓上大大...時間我已經不記得了TAT...
→ lier1986:電完之後 放在37度LB培養一小時 這個動作我有做
→ lier1986:但是離心取pellet倒是沒試過 但我是有把所有的菌液都塗
→ lier1986:盤
→ lier1986:plasmid 的大小跟insert DNA的大小都跑過電泳確認了
→ lier1986:從XL1-blue抽出來plasmid的量也用nano drop測過
→ lier1986:抽出來的plasmid濃度最高到122ng/uL 應該是沒問題的
→ lier1986:這幾天又做了別的實驗 如同micocat所說
→ lier1986:將plasmid轉到XL1-blue和BL21(DE3)pLysS中
→ lier1986:轉到XL1-blue長了很多 但轉到BL21(DE3)pLysS就不長
→ lier1986:但這個結果我覺得不能證明我的蛋白有致死性
→ lier1986:因為如同我文中所講 pLysS是會抑制insert DNA表現的
→ lier1986:我的盤子上只有抗生素 沒有IPTG 基本上重組蛋白是不會表
→ lier1986:現的
→ lier1986:反而更讓我覺得 應該是有什麼原因 使得plasmid轉不進去
推 dennisyoung7:但是單獨pET20b轉入BL21(DE3)pLysS就會長...
推 dennisyoung7:印象中我用的vector好像有6k bps  也是很好轉囧>
→ lier1986:嗯 我自己做也是這樣 轉pET20b很簡單
→ lier1986:但是 有insert的轉了就是不會長