[求救] 得不到insert ....

[solicitousCB (CB)]

老師要我做construct
insert的部分 我先跑PCR 然後拿2ul跑膠check 得到很亮的band
之後PCR產物(38ul)全下去跑膠(load了三個well)
切了120mg的膠去溶 加500ul的GEX buffer
最後用60ul的60度C水去elute
之後跑膠check  照膠結果亮度變得很普通
接著取42.5ul的elution 用XhoI 2.5ul去切 切完之後全下跑電泳
照膠結果 雖然滿淡的 不過用GeneSnap去看還滿清楚的 切膠機下則是勉強看的到
切膠時 膠有260mg 所以我分兩管elute 各加500ul GEX buffer 最後各用35ul水去elute
但是 我取5ul去check時 卻根本沒有東西 >.<
去測DNA濃度 竟然還是負的Orz

我切膠的過程 都是照protocol上走 不過 我發現elute時即使水下在膜中央
水滴還是會歪一邊= = 然後就沒有全都包覆到膜
就會懷疑那半邊的DNA有沒有下來
不知道大家有沒有經驗 能夠幫忙敝人改正錯誤 得到insert呢?

另外想問一下有沒有人的實驗室是用一種不用gel extraction
而是直接用吸起來的電泳槽? 不知道那個要多少錢呢?
謝謝

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◆ From: 140.116.235.109
推 tsubasawolfy:切膠回收率有2/3就可以偷笑了 連做兩次就越來越低..
→ tsubasawolfy:RE完直接做purification 現在很多kit gel extration
→ tsubasawolfy:跟purification都用同一組 去看一下protocol吧
→ blence:有些gel extraction manual有寫,低於50ul水,elute效率更減
→ solicitousCB:不過我的產品說明上面說15~30ul為佳耶QQ
→ solicitousCB:請問purification和 gel extraction有啥不一樣嗎?QQ
→ solicitousCB:我們實驗室兩個名詞好像指的都一樣的東西
推 tsubasawolfy:purificationg是指PCR完或者RE完 直接加入binding bu
→ tsubasawolfy:ff(每家廠商名稱都不一樣)混合均勻後過spin column
→ tsubasawolfy:->wash->elute 可以拿到濃度較高的sample, insert部
→ tsubasawolfy:分用RE切下來的bp少 用跑膠分不出哪些沒切哪些有切
→ tsubasawolfy:而且量又不像vector可以一次大量取 所以vector 部分
→ tsubasawolfy:RE完會做切膠純化 insert部分就直接純化
→ rasaze:我也是一直碰到差不多的問題，elution後濃度低到誇張
→ solicitousCB:我們實驗室有Gene-Spin這產品 請問是purification嗎?
→ icome:insert別做gel extration 我已經發生很多次慘案...
→ icome:尤其越短的回收率越低...
→ icome:其實你的東西還在 只是低到用膠看不到
→ qumai:不要跑膠直接回收吧
→ Ice9:不要在R.E.作用前做膠回收，會切不好。