[求救] PCR一直有band

[popopig2000 (Chingching)]

大家好

實驗希望以real-time pcr方式

量化轉染效率

於是設計一段primer可以夾出質體上的片段

primer所夾的位置位於質體上的

lac operon sequence到ori的區域

預期所夾出來的片段為140 bp

此primer已做過blast不會抓到任何human genomic DNA

但是不知為什麼

就算沒有transfect的細胞或是只用ddH2O當negative ctrl

都還是有訊號被偵測到

例如有轉染的細胞Ct值大概是12-13

但沒轉染的細胞或ddH2O,Ct值也有22-23

做了不同次, 不同sample也是一樣

使用的reagent已全部換新也是一樣的結果

請問板上的高手什麼會這樣呢?

好困擾呀, 拜託各位了!




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 163.25.94.60
→ mzac1b:既然有band就拿去定序看看?
推 qiet:有跑過膠?大小也是140bp?
推 zoom8080:primer dimer? 有看過melting curve嗎?
→ popopig2000:跑膠的大小也是140 bp, melting curve也是完全重疊
→ popopig2000:一樣的位置
→ popopig2000:全部的sample都只出現一條band且都在相同位置
→ popopig2000:為了排除抽DNA污染,也有跟同學借DNA來跑, 也是有band!
→ popopig2000:感謝1,2,3樓的回覆, 到底為什麼會這樣啊?
推 mesenchymal:連只有水的也有140 bp那條band嗎??
→ solomo:重新設計 1.換位置 2.加長primer 3.提高primer等級
→ solomo:也可能是整套實驗器材汙染
→ Anvec:primer 被汙染了?
→ Ianthegood:也是正確size大概是污染吧
→ popopig2000:全部的東西都有重配, primer是拿stock再稀釋
→ popopig2000:所以是stock污染嗎?
→ popopig2000:沒錯,只有水的也只有140的band!
→ decyen:pipetman汙染?
→ mzac1b:所以要買新的primer 來測試嗎 @@!!
推 icome:汙染了 所有的東西換新的 連pipetman都要清
→ popopig2000:謝謝大家的意見, 我已經訂了新的primer, 並且重新設計
→ puec2:pipetman汙染啦
→ puec2:你改用filter tip試試看就知道了。