[求救] 關於RT-PCR mRNA的QC與濃度問題

[garlic774 (蒜頭)]

如題

小弟目前在進行animal tissue(cell culture)的RT-PCR

當時低密度的種到6 well 的plate中

第七天收以RLT 1ml/well去收細胞

再進行RT-PCR(promega)

可是遇到兩個問題

1.最後測的RNA的濃度只有10 ng/ul，不知道是細胞一開始都沒收下來，還是RNA

降解得太快?這樣去上PCR，能轉的出來嗎?

2.260/230 = 0.2

  260/280 = 2

  QC很差，是有機物汙染太嚴重了嗎?如果是要如何解決?

謝謝!!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.24.23.219
※ 編輯: garlic774       來自: 114.24.23.219        (03/21 19:55)
→ williamyang:10 ug/ul很濃的說,該不會是10 ng/ul吧?
※ 編輯: garlic774       來自: 114.24.23.219        (03/21 21:37)
→ garlic774:是ng沒錯，謝謝W大
→ Ianthegood:qc的值在濃度太低的時候就沒什麼參考價值了
→ Ianthegood:應該把前面culture還有抽的protocol reagent講一下吧
今天和學長討論過
發現有三個問題
1.在用RLT溶解細胞時，沒用刮杓

2.因為是一個well 1ml的RLT 輪流用在每個well，每次RLT都會殘留在上一個well

3.在晰出RNA時應該用應降低RNAse free water(20ul -> 15ul)

不曉得還有甚麼可以改進的地方呢?
※ 編輯: garlic774       來自: 140.112.131.184      (03/22 13:59)
→ huuban:我有看過完全smear的RNA 260/280有1.9以上唷
→ huuban:你說的 QC 是 Bioanalyzer 嗎？