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目標是15k的genomic dna 使用了好幾種方法都P不出來 Polymerase是kapa的long range hotstart pcr 號稱最多可P到20k 我的做法: 一開始怎麼P都是smear,懷疑是primer太短(20 bp)_ 後來改成28~30 bp的primer去p 一開始夾不到東西,後來降低annealing溫度(TM-10度) 還有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P 夾的到東西但都是10K以下 有加上NESTED方法去P但都是SMEAR 做法是根據PROTOCAL 94度C 3分 94 25秒 tm-10 15秒 68 15分 共10 cycle 94 25秒 tm-5 15秒 68 15分加上每cycle增加20秒 共25cycle 72度c 15分 請問我該怎麼調整呢 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.29.210
crazybrian:genomic DNA濃度也有影響~可以稀釋看看 03/24 18:00
Ianthegood:annealing加長有時候會有用 03/24 19:42
sylvialalala:我的dna濃度只有20~70 ng,這樣還需要稀釋嗎? 03/24 21:50
sylvialalala:另外爬文有看到增加denature的時間,請問這樣有用嗎 03/24 21:50
keepseaching:你的Tm值是幾度阿,會smear有可能是primer專一性不夠 03/25 02:30
keepseaching:若這是要用在construct上,只能加長primer提高Tm值 03/25 02:32
micocat:可以試試看提高denature溫度 98度之類的 03/25 10:18
lesswind:還是你要分兩段夾... 03/25 13:57
joseph103331:genomics這個濃度可能還太高 kapa不是有說明書? 03/27 11:45
joseph103331:看看上面怎麼寫 PCR煩就煩在一定要做出來才知條件... 03/27 11:45
sylvialalala:tm 55 P不到後改50又p到太多~所以目前用53,54度 03/27 21:17
sylvialalala:kapa上面沒有特別說,但我有去看他的example濃度差 03/27 21:18
sylvialalala:不多說~目前有提高denature時間但不敢提高溫度怕酵 03/27 21:19
sylvialalala:素失效~ 03/27 21:19