Re: [求救] long pcr p不出來

[e2653495 (melanogaster)]

※ 引述《sylvialalala (sylvia)》之銘言：
: 目標是15k的genomic dna
: 使用了好幾種方法都P不出來
: Polymerase是kapa的long  range hotstart pcr
: 號稱最多可P到20k
: 我的做法:
: 一開始怎麼P都是smear，懷疑是primer太短(20 bp)_

有smear是product還是template?
在product表示Ｐ到很多東西，很雜，專一性不夠
（可能是primer，可能是PCR條件沒抓好）
如果是 template表示DNA斷光光，要Ｐ出東西會有困難，
也有可能是template濃度太高，請稀釋。

建議你採取nest PCR方式進行。
還有Ｐ的cycle數那麼多，extension 時間又那麼長，你的polymerase後面還夠力嗎？

以上，建議一下下。

: 後來改成28~30 bp的primer去p
: 一開始夾不到東西，後來降低annealing溫度(TM-10度)
: 還有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P
: 夾的到東西但都是10K以下
: 有加上NESTED方法去P但都是SMEAR
: 做法是根據PROTOCAL
: 94度C 3分
: 94    25秒
: tm-10 15秒
: 68    15分   共10 cycle
: 94    25秒
: tm-5  15秒
: 68    15分加上每cycle增加20秒   共25cycle
: 72度c 15分
: 請問我該怎麼調整呢
: 謝謝

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※ 編輯: e2653495        來自: 140.114.95.98        (03/27 18:17)
→ sylvialalala:謝謝！我smear是product!可是primer有blast過應該專
→ sylvialalala:一性蠻好的？我的extention是根據kapa建議1kb/1m,
→ sylvialalala:KAPA號稱可以p到20k，所以酵素應該不會有問題？目前
→ sylvialalala:有用nest方式在試試看，只是買了kapa就是想一次p長
→ sylvialalala:一點～～～好苦惱
推 lyu0001:如果是要拼human genomic DNA，找一下BAC clone
→ lyu0001:有沒有你要的片段