[求救] Western：Protein ladder消失

[kohkoe (kohkoe)]

小弟最近遇到Western的問題，

最近跑SDS-PAGE時protein ladder會在電泳過程中逐漸消失擴散，最後幾乎全不見，
但gel底部的dye很清楚，認為蛋白質應該沒跳海，不過我這幾天開始懷疑了...

以下是transfer前，gel染CBR的圖片
http://ppt.cc/wHDR

如圖所示，左邊ladder約只剩100和70kDa還看得到，其他位置已經不見了；band也變很淡
且很多位置的band都消失了，背景可看到蛋白質跑過的痕跡。

我電泳的條件是，
5% stacking gel, 10% running gel, 定100V跑1小時50分鐘.
蛋白質loading量為40 ug, load體積5 uL的protein ladder及20 uL的samples.

我已排除protein ladder的問題，因為是新買的且有人跑很清楚沒問題。
我running buffer重新配(pH8.3)，但近3次跑仍然ladder消失(最後連b-actin都看不到)

目前我認為可能是gel的問題或跑電泳電壓的問題(雖然我之前跑10次以上都沒問題)
請各位大大分析可能的問題，我該如何做？
先用低電壓(60V)再用高電壓(100V)跑嗎？或增加gel的濃度比率？

最後，另想問兩個問題，
1. 即使dye沒跳海，上面的蛋白質有可能先跳海嗎？
2. sample loading的體積會影響跑膠嗎(如load 4 uL和20 uL有差嗎)？

以上
謝謝各位耐心的大大看完我的問題！

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.94.11
補上transfer後的圖
http://ppt.cc/TptN
可看到ladder的顏色都擴散了，紅色已擴散到下面了。
這時間還在實驗室請各位務必幫小弟troubleshoot 拜託了！
※ 編輯: kohkoe          來自: 203.71.94.11         (03/30 04:53)
→ Invec:感覺有點像running buffer太熱造成的效果
推 tsubasawolfy:如果你其他條件都跟以前一致 那先從做膠的東西開始
→ tsubasawolfy:換呢？下膠的buffer, acrylamide這兩個
→ kohkoe:膠的buffer我已經配新的了
→ kohkoe:band消失有可能是gel過熱? 但我的band跑很平耶
→ lovesteve:應該是running buffer太熱,我們之前也有過一樣狀況
→ kohkoe:那該怎麼解決? 放冰上跑嗎
→ blence:不需放冰上,如果100V還會gel過熱,就要檢查各種buffer配法
→ mars52013146:查過transfer buffer 的ph值了嗎?
→ kohkoe:樓上 我目前問題是卡在跑膠
→ kohkoe:我確認過running buffer配法沒問題...
→ kohkoe:有可能是配膠的10% SDS的問題嗎 這個我沒配新的
推 mesenchymal:之前我們lab SDS壞掉,跑出來的膠也是很怪
→ mesenchymal:72 KDa紅色那條跑到95 KDa上面去
推 pichia:為什麼不換個Ladder試看看
→ blence:最近running或gel prep新配了什麼,就是什麼那個出錯了
→ blence:尤其是Tris-HCl最常先用完,然後配新的就出問題