[求救] 關於semi-dry 小分子transfer

[jasmineapple (席得)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題


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想請教各位大大



以前western我只用過濕轉的方式

不過現在我要用的是semi -dry

第一次用semi-dry時不是很熟悉  我要看的蛋白質大小約17kDa

那時候使用15v  30min  後來transfer完看到效果不好 ( 就是大分子的marker沒有過去


但是小分子約10KDa附近都有過去)  所以我又繼續給他tran了30min 所以這次的條件為

15v 60min    後來時間一到還是有一些大的

marker沒有過去  我想應該是氣泡的關係造成這樣的結果  不過因為我要看的蛋白大小ma

rker友過去(約15KDa ,10kDa   )

所以我就繼續往下面的步驟了(blocking...1AB)而這次結果雖然有壓出band  不過

不是我預期的結果   所以我又重新製備sample

後來這次tranfer我就follow第一次作的條件  15v 60min  這次也有避免有氣泡

後來transfer大分子過去了  但是我小分子15kDa  10kDa的marker卻沒有在membrane上

想請問各位大大  是因為小分子跳海了嗎(是否transfer太久)?  我是不是應該把

時間調短15v 30min  或15v  15min  哪一個比較適合呢?  謝謝各位大大












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◆ From: 140.114.97.153
→ keepseaching:照你的敘述似乎不像是時間的問題
→ keepseaching:是不是你的membrane沒壓好？？
推 doban:我的蛋白10kDa 我semi-dry條件設定電流(濾紙面積*0.8) 60min
→ jasmineapple:第二次作時有很注意是否有氣泡的問題 所以加一層濾紙
→ jasmineapple:都有用管子嚕一嚕  把氣泡趕走
→ jasmineapple:所以應該是不會沒有壓好   我想
推 stormcorn:我覺得是小分子跳過頭了....
→ jasmineapple:樓上  我也覺得是耶  我有爬文  有人說廠商建議15v
→ jasmineapple:15min 或是10v 30min  果我用後者的條件 結果小分子
→ jasmineapple:的marker步見了  只剩下大分子的marker
→ jasmineapple:而且膜後的那張紙 有淡淡的marker
→ jasmineapple:這樣該改甚麼樣的條件好呢?