[求救] histone的western blot

[chen95982000 (元元)]

我們要看的是non phospho-H2AX

sample 都是whole cell lysate, 然後顯色我們是用ECL,

non phospho-H2AX一直都沒有band

internal control我們用beta actin  有非常清楚的band

transfer buffer我們用的是:

25mM Tris-base, 192mM glycine, 20% methanol, pH8.3

膜用的是0.45 um pore size 的 PVDF

tansfer time: 250 mA, 2 hr



我看到histone的PI值好像是9, 10左右

所以主要原因是transfer buffer的pH值問題嗎? 或是0.45 um這個膜的pore size太大?

我如果調高transfer buffer的pH是不是又會影響其他protein的transfer?

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◆ From: 140.112.121.239
推 tsubasawolfy:當你sds上去後pi啥鬼都一樣 PVDF不會 你可以試試不同
→ blence:說不定是extraction的問題，用PSB煮就可以確認了
→ tsubasawolfy:家Ab或者可以拿到純H2AX protein去證明你的一抗問題
→ tsubasawolfy:或者抽核蛋白 因為一般lysis buffer(沒加sds)不容易
→ tsubasawolfy:把histone從DNA上扯下來 最直接方法就是細胞收好加
→ tsubasawolfy:1X sample buffer煮一煮離心跑膠（跟你的lysis比
→ a90648:可以參考abcam的抽histone的方法
推 kakaman:做過磷酸化的,抗體是Abcam的樣子,似乎不難壓~
→ chen95982000:樓上有做磷酸化的話不是也都會做非磷酸化的當做
→ chen95982000:control嗎? 就是"total的H2AX"
推 kakaman:因為沒錢買普通的...