[求救] Western blot nuclear protein

[ch90331 (迷途羔羊)]

大家好
最近想抽cytoplasmic protein 和 nuclear protein

使用的方法是老師提供的配方 原理大致是利用滲透壓的方式

也就是先利用Hypotonic buffer去脹破細胞膜 最後使用Hypertonic buffer來取細胞

核蛋白

但在使用hypotonic buffer作用於細胞時 要避免作用時間太久 同時也把核膜弄破

因此要做一個預實驗 先抓出一個時間點 這個時間點可以剛好讓質膜破掉又不會破壞核膜

採用的方法是用trypan blue 染色 去顯微鏡下觀察 若細胞質的部分全變藍色

表示質膜應已破 所以最好的情形是我會在細胞看到中間的核未被染上而呈現亮亮的情形

嗎?

預計作用時間大致於2~5 mins 所以我應該在hypotonic buffer一加到細胞後便到顯微鏡

下觀察整個細胞染色的情形嗎? (也就是觀察染色動態....)

是真的有必要這麼麻煩嗎? 因為看網路上的protocol也沒有特別註明要到顯微鏡下觀察

而且核膜真的有這麼容易破嗎? 因為在加入hypertonic buffer後取核蛋白還要作用

30 mins耶  如果真這麼脆弱 後面的作用方式有必要那麼久嗎?


希望有經驗的前輩可以分享經驗  或是有什麼比較好的方法可以提供呢?

麻煩解答了, 感激不盡~~~


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◆ From: 101.14.144.225
→ Ianthegood:顯微鏡下觀察2-5分鐘你嫌麻煩...
→ Ianthegood:而且兩個mechanism不同
→ blence:覺得會染色後呈現一部分核破一部分膜還沒破的情況,還有死細
→ blence:胞的干擾
→ blence:我看到的方法是用1~30min取cyto後,再用WB觀察最佳的時間點
→ tengjing:去染nuc/cyto protein 會比較可信吧