[求救] Trizol前可以用PBS wash?

[libraq (Sky)]

  我們實驗室是用trizol來抽cell line RNA,依說明書說加入前不要用PBS wash cell

  問題在加入萃取物處理細胞後,抽出的RNA pellet似乎都會有殘留萃取物(灰綠色),

  雖然用nanodrop測出來的量、260/280、260/230都算正常,

  但不知道為什麼某些組萃取物會導致跑qPCR時,18S都莫名其妙少了快兩個CT,

  我推測是因為萃取物會與RNA共沉澱,導致RTase的活性被抑制,使得RT沒那麼好


  因為已經做了三次實驗,某幾組萃取物都有同樣的結果,應該不是實驗人為誤差

  雖然說CT值都勉強在線性範圍內,但總覺得有點毛毛的.


  查了網路上,有lab protocol說加入trizol前要cold PBS wash,

  有人表示colde PBS wash後,抽出的RNA表現量會大亂,

  invitrogen也說wash後會導致RNA degradation.


  請問到底能不能用PBS wash呢?

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.218.97
推 joseph103331:用PBS wash為什麼會導致degrade? 細胞又還沒破....
http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
我也很好奇，在第二頁寫到
Do not wash cells before addition of TRIzol® Reagent to avoid increased
chance of mRNA degradation.
※ 編輯: libraq          來自: 140.112.218.97       (04/07 00:05)
→ cmublue:我們家是invitrogen的Trizol有分別試過有無PBS的wash步驟
→ cmublue:realtime結果還算正常
→ skyken10:我猜會不會Cold PBS會產生Cold shock~所以不建議使用
推 sunlen:我分離b細胞..分離過程很多PBS wash最後還是可以抽RNA
推 icome:是怕洗太大力會破掉? 反正能不洗就不洗
→ ararthur:怕是PBS裡有RNase吧 若真的有 殘留一點就有差了
→ ararthur:不過我從來都沒有看過灰綠色殘留物... 這裡問題比較關鍵
→ libraq:謝謝大家,最後還是洗了,也找了些paper,找到可能問題的部份