[求救] iNOS跑出來的band

[md183 (十月的兔子)]

大家好我已經有用關鍵字查過相關的問題了

但是還是有遇到不解的地方


最近在壓iNOS和COX-2這兩種抗體 (cell signaling)

iNOS  圖  http://i.imgur.com/3VBDW.jpg

COX-2 圖  http://i.imgur.com/MDXbI.png

一抗 (1:2000)

二抗 (1:1000)


iNOS跑出來很淡，而且有一點一點雜訊的感覺

COX-2是有跑出來，但是跑出來的範圍就不平均，像一坨一坨的感覺




我好奇的是iNOS的為什麼會那麼淡，是抗體稀釋太過頭了嗎?

那COX-2為什麼又跑出來不好看，看paper上大家壓得都很有beta-actin的感覺...

會是收細胞(巨噬細胞)的問題嗎?





請有經驗的人幫忙看看並幫忙解惑~~~謝謝> <

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每個人都把希望寄託在未來，

    卻忘了未來是由每個現在所組成。


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.128.143.163
推 martyrtitan:blocking多久?
→ md183:大約都1個小時~頂多不會超過兩個小時
推 mingchao:蛋白是不是沒抽好~什麼細胞?處理多久?
→ md183:RAW264.7巨噬細胞。是說抽細胞的時後，lysis buffer加進去收
→ md183:時蛋白液會呈現黏稠狀，所以用離心抽取方式取上清液。
→ md183:不然實驗室收蛋白液是不會用到離心機的..
推 martyrtitan:blocking久一點 4度c可以overnight..另外二抗太濃了
→ martyrtitan:cell signaling的rabbit、mouse我都1:5000
→ martyrtitan:另外你蛋白質量loading多少? transfer條件?
→ md183:每孔load 入10ul~約20ug。跑膠時上膠60V 20分鐘，下膠120V
→ md183:約80分鐘，轉漬是0.4V 60分鐘左右~   大概是這樣Q Q
→ md183:不知為什麼iNOS跑出來都這樣 ...
推 Tendin1015:我們也有跑 iNOS..應該不是你蛋白收得不好，頂多是保存
→ Tendin1015:不好..細胞lysis之後黏稠物是DNA，離心把上清移到新的
→ Tendin1015:eppendorf，然後再去跑，你應該是抽到雜質了
→ md183:謝謝你們～~iNOS我blocking久一點~~背景雜質不見很多哩
推 bigpobatin:破細胞的lysis buffer配方可能有問題
→ md183:我也覺得有這可能耶!!!!@ @但我們家lysis buffer是用買的
→ md183:但收不同細胞跑其他的抗體卻沒有這種問題Q ~ Q