[討論] 使用PCR 產物去進行PCR 產生smear?

[mzac1b (Goodday)]

為了在cDNA clone 某約 160bp 的片段

已經得到PCR 產物，single band

原想說將PCR 產物稀釋再PCR 比較好P
但是稀釋不管 1/100000, 1/10000, 1/1000, 1/100
P 的結果都是嚴重的smear，約在數百至數千bp 位置產生smear
甚至做了gradient 溫度梯度仍然都是smear 的結果
看不見single band

但同條件用cDNA P 又得重新得到預期的single band

雖然我們後來決定乾脆還是由原本的cDNA 重頭來放大
但仍很好奇smear 怎產生的?

有人有同樣的經驗嗎?

感謝分享~




--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.60.122.200
推 f9361046:你不覺的用PCR產物在進行PCR 非常不適當嗎
推 kingbar:我有這種經驗!我想是原本的PCR產物雖然經過純化，但裡面
→ kingbar:其實還有微量的non-specific band，因為長度比較短，
→ kingbar:再次PCR時就比major band更容易被amplify，目前尚無解法XD
→ kingbar:回一樓:有時從cDNA P出來真的很微量，但因實驗需求需要
→ kingbar:較濃的產物，就會想試試這個方法。
推 joseph103331:真的要用產物P 我會建議切膠elute後再P會比較好
推 arlix:smear是因為第一輪的PCR產物中其實有許多Polymerase沒跑完
→ arlix:所形成長短不一的片段，但在第一輪中的量不足在膠體中看見。
→ arlix:然而在第二輪PCR時，這些訊號同時被放大，所以就產生了smear
→ arlix:另外也推J大切膠出來當template.