[討論] 關於一個His-tag pull down的問題

[aggaci (可找我下棋..)]

   請問大家一下
   最近在做His-tag pull down assay
   我把6H-A(A是我的蛋白質)加到cell lysate裡
   反應完後加Ni2+ resin把6H-A抓下來
   目地是想看a是否會跟其它蛋白質結合....
   我bead洗完後直接加2X sample buffer拿去煮再連bead一起loading

   我把a分子量附近的page切下來用CBR染色
   結果我並沒發現a的蛋白質
   (我納悶了好久..........我確定6H-A可以結合Ni2+ resin)
   我能想到的惟一原因是a還結合在resin上並沒朝正極移動，
   因為6H跟Ni2+結合能力很強

   有沒可能是這樣??
   若是這樣那下次恐怕得用imidazole  elute出來再跑了
   若不是..........我還真的一時想不到原因.....

   謝謝


--

 單身不代表寂寞，寂寞是走在一個不愛妳的人身邊的時候。

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.116.253.121
→ blence:in vitro pulldown後直接加PSB煮都可以看到蛋白阿,該不會你
→ blence:加的His-tags不多,還用CBR的話就看不到了
推 joseph103331:做pull down assay要用抗體偵測吧? 那量在CBR看不看
→ joseph103331:得到真的很難講 建議你用抗體看看比較好
→ joseph103331:畢竟你也不是做純化嘛
→ aggaci:我想您說的是ip...我的是用大量recombinant protein去抓歐
→ aggaci:我後來用imidazole去elute時ok，我得再做一次