[求救] 冷切包埋前先用PFA處理檢體?

[mikis1107 (mikis1107)]

最近有聽到一個方法是
在包埋OCT前組織先用PFA處理
要染色前section用macrowave antigen retrieval
之後再用2%的serum blocking

不知道有沒有版友是用這種方式

因為最近片子上的granules實在有點多
http://ppt.cc/xR(M

實驗方法之前有po過請神人校正
應該是沒啥問題

有試過改善方式:
1. wash久一點--->沒用
2. Fix條件更改: (1) Aceton 20% cool-->染色不均, 有雜質
                (2) Aceton 100% cool->染色不均, 有雜質
               *(3) PFA      4% RT--->染色較均勻, 有雜質顆粒 (現在使用)
                (4) 0.4% gelatin+3% goat serum-->其他實驗室提供,目前在試條件
3. 1級抗體稀釋倍率: 1:200, 1:400, 1:800
                   ^^^^^^^
                   現在使用

4. 2級抗體稀釋倍率: 1:500

但目前似乎還是沒辦法解決
所以想說該不會是從一開始包埋的方式就有問題

由於是人類檢體
都是由開刀房學姐幫忙包埋我再切片

現在的包埋是請學姐將組織清洗乾淨後
放進裝有oct的錫箔紙圓盒中
將紙盒放進含有少許isobutenal的罐子
(避免急速冷卻下冰晶形成太快破壞組織)
再一起放入小型液態氮桶中

如果有較詳細包埋的步驟也請好心的版友寄信給我可以嗎??
謝謝T___T


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◆ From: 223.139.180.67
推 goshr:幹嘛不用石蠟包埋呀, 反正都要retrieval了...
→ mzac1b:同樓上 凍切好處是較好染 但片子很破
→ mzac1b:蠟切切片美觀但福馬林泡過要 retrieval 就不見得好染
→ mzac1b:又泡福馬林又凍切 不就美觀和好染兩種好處都沒有?
→ mikis1107:所以G大M大都是用石蠟包埋染螢光嗎???
→ vandia:石蠟包埋之後染IHC也不錯
→ mikis1107:老闆想要看螢光的數據@@
→ mzac1b:都有做過 蠟切ICH 較麻煩 不過只要抗體好染雖麻煩也不錯
→ Nofetete:我的是老鼠的ankle 包埋前先4%PFA 4度c overnight
→ Nofetete:(因為還要泡EDTA脫鈣)，IHC的前處理則是用Proteinase K