[求救] internal ctrl出不來

[ElmoPU (pupu)]

最近遇上了怪事
進行western blot
無論是跑學姊的sample 或是我自己的sample
GAPDH怎麼樣就是出不來 或是很弱
(壓片1分鐘還是淡到不行,以往10秒就超強
1st Ab是1:8000,2nd Ab是1;10000)
但是其他的蛋白就都可以detect到
甚至改壓beta-actin就出的來
(所以確認並非sample本身有問題)
本來學姊推論是否是小於40kD都出不來
可能是running或transfer bfr有問題
(因為我剛好有配新的,懷疑可能有配錯)
但是我向其他人借了bfr跑出來
跟以往一樣 有一個14kD的蛋白一樣可以detect到
而且signal還很強 所以顯示並非小於40kD就無法detect
1抗也換過5支了而且都是別人確定是work的
2抗也有換過了
我實在不知道還有哪裡可能會有問題...
有可能是washing bfr嗎?
但是這樣不是應該整片都有問題?
而那個range(約莫26-43kD)去hybrid另一個測phosphorylation的1抗
即使是壓片1秒也是一片黑
但是別人用同樣的抗體 就不會
有可能是我哪個環節出了問題才導致這個問題的產生呢?
PS半個月之前,一切都很ok,GAPDH都很美麗的阿....
  這段期間,washing和transfer bfr有重新配過stock
  然後Tris pH8.8也有補充
  有換的東西應該就只有這三樣
  已經確認running和transfer bfr應該是沒問題的
(因為用別人的跑一樣壓不出GAPDH)
請問有人知道有什麼會造成這問題嗎?
謝謝!!!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 118.169.215.217
→ justname:請別人幫你跑一次看看?
推 FireHell:一抗是不是有REUSE? 有的話重配
→ ElmoPU:一抗是reuse沒錯，但也已試過重配仍然不行。
→ ElmoPU:請別人跑是最後方法了，畢竟大家都很忙...
→ ElmoPU:我現在懷疑的是Tris pH8.8和washing bfr
→ ElmoPU:但實在沒道理整張membrane就那裡有問題...
推 FireHell:一抗哪一家的？我是覺得配太稀了
推 windyflyer:我們家的gapdh一抗1:10000 二抗1:7000 這樣就很亮了0.0