[求救] IMAC純化His-tagged protein,Imidazole?

[f52cya (SWD)]

各位先進好:

小弟最近嘗試使用AKTA FPLC系統接上自行packing的管柱來做親和性層析

欲純化His-tagged 重組蛋白

使用的是GE的Ni sepharose 6 FF膠體

於管柱packing方面並沒有太大問題,也可以順利接上FPLC系統

我使用緩衝溶液成分為50mM Na2HPO4、300mM NaCl及Imidazole, pH8.0

FPLC系統泵浦分二,於是我配了Imidazole低濃度(0mM)及高濃度(500mM)的緩衝溶液

利用AB動相比例分配調Imidazole的濃度,

使得Binding、Wash、Elution分別為10mM、20mM、250mM

管柱經Binding的濃度平衡後,試打純水作流程測試

UV偵測器調整成三種坡長偵測(280、254、215nm)

結果發現當進行到elution的步驟時，訊號一下子升了很高(從10升到500mAU左右,280nm)

而且持平一段時間才降下來(約5CV,剛好是我Elution的時間)

於是我猜測是Imidazole本身的吸光導致,但也困惑了...

若Imidazole本身有吸收,這樣我欲純化的蛋白會不會就這樣而看不到有沖提出來

(我試著用其結構來猜測會有吸光,254nm應當一定有,280nm就不確定)

並且我翻了翻GE的產品目錄,在相關IMAC的產品介紹中,

也是使用Imidazole來做Elution並且濃度是500mM

但不同的是,在500mM的濃度下,除了沖提出來的蛋白峰之外,其餘時間的訊號很低不到50mAU

搜尋網路上有關於Imidazole的資訊,我也看到說Imidazole不會有吸光

因此...是我的Imidazole有問題嗎? 目前考慮重配

Imidazole究竟會不會吸280nm的光呢~?

謹請各位提點

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.164.140
→ trumpet:imidazole在280nm會吸光(原po可直接用分光光度計測就知)
→ trumpet:一般如果你的protein濃度太低，會被imidazole背景蓋掉
→ trumpet:所以建議每個fraction都收集，然後用分光光度計另外再測一
→ trumpet:我也在網路上看到說不會吸光的，但是我用的就是會吸光
→ satantaco:wash時間拉長~~elute的梯度拉緩 或者program先拉一低
→ satantaco:低濃度平衡後再拉梯度   參考看看嚕   很久沒碰了
修改倒數第五行單位
※ 編輯: f52cya          來自: 114.27.132.227       (05/08 23:21)
→ f52cya:感謝樓上兩位大大幫忙!
→ f52cya:其實我剛剛又再查了一下,發現如果是品質不佳的imidazole
→ f52cya:會有吸光的問題,high quality的則幾乎沒有~
推 muscidae:的確是quality的關係,不過不至於會蓋過sample的吸光。