[求救] Far-western blot

[nhxcyge (人生就像個不可逆反應)]

請問各位版友們有沒有做過far-western blot，

目前想用這實驗看protein protein interaction。

老闆說的protocol感覺怪怪的，我列出來讓大家看一下。

1、將sample load到wells跑SDS-PAGE。

2、Transfer到nitrocellulose membrane。

3、利用欲看interaction的純化蛋白(prey)，加入TTBS，使最終濃度(1ug/mL)。

4、用可偵測prey的一抗去認，再用相對應的二抗去認。

我看到網路上有一些protocol是在第二步和第三步中間，有一個blocking的步驟。

想問一下比較正確的方法是什麼呢？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.95.199
→ shenhsu:就跟一般western一樣 想要background乾淨一點就blocking啊
→ nhxcyge:我在想在membrane的protein都已經denature了，所以用prey
→ nhxcyge:再去跟bait反應時，會跟在細胞裡一樣有反應嗎？
→ nhxcyge:我是怕denature後的protein已經看不到interaction了@@
推 joseph103331:那為什麼不做IP? 應該有個理由吧...
推 tsubasawolfy:不做ip應該是想省抗體錢還有相關器材？另外原po考量
→ tsubasawolfy:是對的 你可以去問你老闆呀￣▽￣||
推 leoblack:抱歉~學藝不精~沒學過far-western blot,查了一下發現是
→ leoblack:用non-Ab protein當probe~所以~strepavdin-biotin這種就
→ leoblack:可以算是far-western blot的應用嘛?!感謝指教
→ shenhsu:我以為是問blocking 抱歉XD 如果是denature問題 應該要跑
→ shenhsu:native gel?
→ nhxcyge:其實我做過IP，只是要說明protein-protein interaction
→ nhxcyge:需要更多的DATA去證實XD
推 williamyang:GST pull down
推 joseph103331:推GST pull down...反過來用His也OK
推 icome:Far-western不是很好做的樣子.. IP和GST算是目前主流
推 kirby0415:transfer後用guanidine-HCl denature後,TTBS renature,
→ kirby0415:milk blocking, 加入prey protein, 之後再加入可以認
→ kirby0415:prey protein的Ab~我真心懷疑原po跟我當初同間lab.....
→ nhxcyge:樓上是嗎XD