[求救] RT-PCR出不來

[firstfrost (阿水)]

請問板上各位強者

因為小弟現在開始碰到要抽取大鼠spinal cord組織mRNA的實驗

使用的是Q牌的kit(好貴...)

但是抽出來的RNA濃度大約只有100~200ng/ul(好少...)

而且在做RT-PCR的結果中

不論哪次抽的組織

TNF-a(40cycle) IL-1b(35cycle) GAPDH(25cycle)都可以順利P出來

但是IL-6卻是只有第一次抽的組織P的出來(primer沒問題)

之後抽的組織跑出來都空空如也(但是TNF-a IL-1b GAPDH都正常)

而且IL-6都發神經跑到60cycle...還是空的

實驗步驟如下:

組織取下來放到RNA later保存4度C overnight

隔天取出來放入RLT buffer中以Microson的sonicator打破組織至無塊狀

之後離心並加入70%EtOH

再來就是讓RNA binding在Kit附的膜上進行一連串的wash

最後用50ul RNase free water elute

RT轉1.5ugRNA

PCR時取4.5ul的RT sample(總體積50ul)

以上全部都大手筆買Q牌的kit...

但還是卡在IL-6無法正常P出來的狀況

如果RNA被震斷裂 那GAPDH還跑得出來...?

但是通常作一組實驗(無加藥老鼠組 加藥老鼠組 無加藥治療老鼠組 加藥+治療老鼠組)

共4個spinal cord sample卻會出現只有某一組IL-6可以PCR出來，其他組都不行...

但是mRNA都是同時抽 同時轉RT 同時PCR...


感謝各位看完這麼冗長的實驗經過 也請給些意見 感謝!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.60.122.10
推 puec2:pipetman污染 拆開來清洗+滅菌以後應該會全都p不出來
推 jabari:control的功能就是告訴你rna is fine.. primer換過吧
推 satantaco:有一種東西叫filter tip~~然後勒  某些品牌會告訴你
→ satantaco:filter的作用是保護你的pipet不會爆衝  但是正確的品牌
→ satantaco:會告訴你  filter的意義在於防止上下端gas層的交互汙染
→ satantaco:所以  選用正確的filter tip可以避免你的pipet汙染問題
→ satantaco:另外某些pipet會告訴你整支可以拿去菌 請不要再相信拔
→ satantaco:獅子鬆毛可以...的傳說了  pipet上端的機心不能拿去滅菌
→ satantaco:原因在於  機心內有機械的連機點  還有螺絲等各種構造
→ satantaco:在高壓高溫下  每個部見的膨脹系數都會不同  然後冷卻
→ satantaco:時冷縮的係數也有差  因此整支拿去滅只會讓你的pipet提
→ satantaco:前壽終正寢   除機心之外的部分則是可以拆下後滅菌的