Re: [求救] 請教realtime PCR 定量

[ckr (琴心)]

: 最近在整理 PCR資料的時候想到的問題
:
: 如果實驗本身做了三重複  得到三個cDNA sample (a, b, c)
: 接著PCR對每個sample做三重複，2^-dct method 得到9個資料點
: (a1, a2, a3, b1, b2, b3, c1, c2, c3)
:
: 請問各位板友，下面三種資料呈現方式哪一個比較正確呢？
:
: 1. 選擇三次實驗中具代表性的一次，如(a1+a2+a3)/3±SD, n=3
: 2. (a1+a2+a3+..+c1+c2+c3)/9±SE, n=9
: 3. 取三次實驗各自的平均值，a', 'b, c'，接著以(a'+b'+c')/3±SE, n=3
:
: 推 williamyang:若是實驗結果趨勢是一至的,選1                        05/30 14:20
: 推 icehikki:我都用二                                               05/30 15:18
: → blence:如果是上述cDNA定量,用1.是測你的機器的mechanistic error   05/30 15:56
: → blence:做100次也沒有意義,應該用3.才能比較代表三次exp的error     05/30 16:01
: → blence:至於其它實驗端看你計算平均值時想要呈現的SD代表什麼意義   05/30 16:03
: → ckr:謝謝三位板友的意見                                          05/30 19:20
: 推 qqmango:2是錯的，應該是用3，1的話會有主觀選擇的偏差問題         05/31 01:24
: → ckr:謝謝q板友的說明                                             05/31 09:53
: 推 bigtuna:3不知會不會把"人為誤差"給忽略了，用2似較能算進人為誤差  06/03 01:55
: → bigtuna:不過不是很確定，也想要和大家一起討論:)                  06/03 01:58


昨天與學統計的朋友交換意見  他是不贊同2這個方法的

2的問題在於把九個資料點視為九次獨立事件
但我們都知道同次實驗三個測量值(如a1, a2, a3)三者關係比較接近
而不同次實驗的測量值之間(如a1, b1)關係比較遠
所以這個方法邏輯上有漏洞

因此在三個選項當中  3似乎是最合乎統計學理的
但或許九個資料點也可以用repeated measures的角度切入?(Friedman's test?)
這得要請教對生物統計更專精的板友了


順帶一提
學統計的朋友對於我們多半選擇t-test或ANOVA很訝異
因為在n值很小的時候  應該是要用non-parametric的方法才符合學理
(Mann-Whitney or Kruskal-Wallis)
而且描述non-parametric data的時候  不應該是用Mean, SD, or SE
應該改用Median, IQR等


老實說  討論之後覺得更頭大
從我淺薄的統計修課所得的認識  用non-parametric的方法確實比較合理
但在閱讀期刊的過程當中  似乎沒見到用non-parametric方法在處理realtime PCR資料


※ 編輯: ckr             來自: 184.57.23.82         (06/04 06:47)
推 lingon:大多數人就將錯就錯.... 習慣就好了
→ ckr:可以請教lingon大都選用上面哪種方式分析嗎?
→ blence:2不能說完全不對，當每一次種細胞就分三盤取得的data,連續
→ blence:重複這樣的實驗共三次，就能用2,當然這時也可以用3甚至1,
→ blence:總之重複實驗是為了暸解並排除誤差,不同方法的解釋就會不同
如果我們假設今天的細胞跟下禮拜沒有差別  我同意b大的實驗設計可以用方法2
但我原文提出來的狀況是一個RNA sample做三次PCR
在這種狀況下  同個sample的三次結果不是獨立的  而會因為實驗設計而高度相關
如此一來好像不太適合給予等同三個sample的地位?

推 qqmango:2絕對是錯的，不然只要做兩次實驗，然後測十重覆的話n=20?
同意q大說法
對1個RNA sample跑10次PCR  可信度應該不如  10個RNA sample各跑1次PCR

我猜b大所謂2的算法可行是指  今天實驗有三盤細胞  明天實驗又做三盤細胞
這樣跟今天一次做六盤細胞的結果都可以視為n=6
(雖然兩次三重複的可信度  似乎略高於一次六重複)

個人的看法是  不論是一次做六重複  或做兩次三重複  都屬於真正的replicate
都有6個RNA sample  n就等於6
至於跑realtime PCR時的重複  嚴格來說應該算是repeated measurements
不能算在n值裡頭
※ 編輯: ckr             來自: 164.107.154.93       (06/05 05:37)
推 qqmango:請見jcb的好文error bars in experimental biology
推 qqmango:那樣仍只是看你的操作再現性而已
→ blence:不同意樓上,因為一次做六隻老鼠,跟分兩次做三隻老鼠量血壓
→ blence:沒有理由前面是n=1,後面n=2,像這樣應該都是n=6
→ blence:你認為不妥的例子應該是一隻測量六次跟兩隻各測三次
→ blence:之前已經說過了,一個QPCR值連續讀十次,對做實驗還是n=1,但
→ blence:對機器與偵測精準度n=10,究底就是每個人立場看待n值有差異
推 qqmango:請見該文章,我想這樣爭論沒什麼意義，對得起自己的數據就
→ qqmango:好
推 allergy1115:N值偏少我的統計老師教我用Linear mixed effect model
→ allergy1115:去作統計.
推 ararthur:用原文的說法的確2是錯的 但如果是每次做三重複 一共做三
→ ararthur:次 應該就可以當作n=9 當然在真正統計學範疇上 這跟作法3
→ ararthur:還是有差別