[求救] RT-PCR從有band到smear

[Ritoo (。)]

最近一直陷入reverse-transcriptase無限P不出來的地獄中，
故想請教有無版友有相關經驗或可能的解決方法。

目前的狀況是，我在測試樣品中的ㄧ個target mRNA表現，
其cDNA大約331 bp，
在測試兩、三種primer後決定了其中一個專一性還不錯的primer，
其為22-mer，GC content為52%，annealing溫度為60度C，
一開始有順利P到我預期想看的產物，
但就在上個月初開始，
產物呈現整個smear的狀況，
但同時間，
ladder marker正常，所以我配置的膠片應該ok (2% agarose gel)，
internal control (G3DPH)的表現也ok，所以cDNA樣品理論上應該也ok，
但預期的target mRNA產物就是完全不見了！！！！！

我目前嘗試過的辦法有：
1) 重新訂製新的primer (序列相同)(試過兩次)
2) 使用新鮮配置的水 (四次水)
3) 換不同台PCR機器進行PCR循環
4) 換訂不同廠商的相同序列primer (試過碩禾和百力)
5) 加1%DMSO下去進行PCR循環
6) 使用不同批抽的RNA轉cDNA樣品進行PCR循環

但結果全都失敗了！
而且每次做的結果都類似，
就是IC和ladder marker很清楚，但想看的產物整個smear，
大致如此圖所示：
http://images.plurk.com/56af144622737aad9f3e922b35175b85.jpg

(左半lane 2-6為IC，右半lane 8-12為預期target mRNA產物)

目前呈現有點走投無路的狀態，
誠摯請教各位版友對此有無任何想法，
非常感謝！


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.189
→ yaprint:template太多或是MgCl2濃度太高?
→ Ritoo:我template的濃度10 ng/ul，PCR是使用EconoTaq kit，裡面的
→ Ritoo:MgCl2是3 mM
→ Ritoo:所以是可以試試看調整MgCl2的濃度嗎
→ huuban:RNA狀況確定OK嗎？
→ Ritoo:有用nanodrop重測過其一樣品，濃度達一千多ng/ul
→ Ritoo:260/280約1.8，260/230約2.2
→ Ritoo:測的樣品都已經轉成cDNA了
推 satantaco:sample是否是馬上抽完就作還是冰凍後解凍再作?
→ satantaco:從你的敘述中   上個月都有  這個月開始不行  會懷疑
→ satantaco:是否是斷掉了  或者被RNase吃掉了   建議重抽馬上作
→ satantaco:如果重抽就做出來了 建議在sample裡加入RNase inhibitor
→ Ritoo:我在處理細胞的習慣上，都是當天早上抽RNA，下午轉cDNA和跑
→ Ritoo:膠，如果已經轉成cDNA也是有斷掉的可能性嗎？
→ Ritoo:另外，我也有擔心cDNA反覆解凍的問題所以在第6點有以另批轉
→ Ritoo:的cDNA進行測試，不過結果一樣是smear
→ Ritoo:上述的跑膠是跑RNA膠片確認品質，轉cDNA與PCR膠片則後續進行
推 icome:GAPDH很清楚的話表示sample沒問題才對
→ icome:這樣子像是沒P到 可能沒表現 或是cycle數不夠
→ huuban:的確有聽過RNA影響到cDNA不耐放的案例
推 satantaco:這麼說好了 control組都有作出來  所以應該不是試劑類出
→ satantaco:狀況 然後primer出問題機率應該不大  因為你之前也批出
→ satantaco:來了  cycle數可能增加一點再試試看
→ satantaco:以前我遇過類似的問題  最後都是出在sample出狀況
→ satantaco:通常放進clone裡的序列  你經由plasmid抽取出來的
→ satantaco:因為經過一些wash的extract過程  所以把鹽類還有有的沒
→ satantaco:的除掉了  所以會比較穩定  如果是RT產物  或者PCR產物
→ satantaco:會比較多變化
→ Ritoo:我是直接抽取細胞的RNA，此target mRNA目前的cycle數是40
→ Ritoo:我明天試試看提高cycle數，感謝各位！
※ 編輯: Ritoo           來自: 111.249.202.61       (06/04 23:33)
推 joseph103331:你的lane8有P出來不是嗎...? cDNA轉完不要放太久
→ joseph103331:單股沒雙股那麼穩定 存不久 看起來是cycle不夠
→ joseph103331:可以試試看提高template與cycle數?