[求救]土法煉鋼做Site-Directed Mutagenesis !

[mkmai0802 (Wengda)]

教授不給我買kit T.T

只好拿實驗室有的東西來Try Try 看 ~

Polymerase 方面的問題 :


一般的Taq -

 會在尾端多加一個A 好像不能用 而且會產生更多突變 !


NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase -

 這個可以用嗎 ? 我很怕他會把single-strand primer 切掉 ~

 我有上它網站查 只有寫說 會產生 Blunt-ended product !

 也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但沒有寫到會不會把Primer切掉 ~

Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase -

 想買這個來用 ~ kit 也用這種的 ~ 具有上述的優點 !!

所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿來用 !!


DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻煩多定序幾顆 ? 是這樣嗎 ?

還是大大在做的時候還是會習慣 要加入這個步驟 比較省事 !!??

Competent cell - 實驗室只有DH5alpa

 DH5alpa 是否也具有將 nicks 修補的功能 !!


煩請熟練的大大分享一下心得 ~

感謝 !!

--

我愛妳 用生命的愛 ~


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.73
推 hangzer:Pru?? DapI?? 你要不要把錯字改一改orz
※ 編輯: mkmai0802       來自: 203.64.80.73         (06/05 15:27)
→ mkmai0802:哈哈 打錯了 抱歉 ~ 忘了檢查 >< !
→ mkmai0802:阿這位大大可以幫我解答嗎 感謝 XD
推 hangzer:基本上我都是用pfu這個polymer做 然後做完一定要用DpnI切
→ hangzer:不然保證你做出來都是沒變過去的 DH5alpha就ok了 只是我
→ hangzer:是用commercial的 效率會比較高
→ hangzer:基本上protocol可以參考QuikChange Site-Directed
→ hangzer:Mutagenesis Kit的份去做 成功率滿高的
推 nhxcyge:我是下10~50ng的template，然後用互補的primers P一圈
→ nhxcyge:plasmid，25個cycles後用DpnI切，切完就照一般的transform
→ nhxcyge:步驟做，然後我也是用自己做的DH5a competent cell.
→ nhxcyge:p.s. 我是用Fermentas的polymerase和digestion enzyme
推 icome:用過pfu和KOD 成功率很高 不過extension時間要久一點
→ icome:要比廠商建議的時間多一倍
→ icome:我也是用QuikChange protocol
推 qumai:pfu跟phusion都可以~ 其實kit也只有polymerase跟DpnI吧XD
→ blence:買零件比較划算，實驗室有現成的都可以用，kit指是把method
→ blence:會用到的賣給你而已，跟成功最相關的primer也是自己設計的
推 aggaci:根本不需要kit阿...你只需要厲害的pfu跟磷酸化的primer
推 lyu0001:Phusion很貴耶 查一查舊文就知道怎麼做的
推 lyu0001:先想好primer怎麼設計吧
推 HOPEFIRE:quick change買pfu跟DpnI就好啦 買kit很浪費吧
→ HOPEFIRE:dh5a就夠用了
推 Nicoleching:1. 我以前就是用phusion在做site directed
→ Nicoleching:2. 買 DpnI + Primer設計的溫度參考 invitrogen kit的
→ Nicoleching:protocol (網站應該可以download吧!!) 就可以很順利
推 Nicoleching:以前買一組kit好像是兩萬多吧...(學姊買的不是我..)