推 joseph103331:這就是two-step的方式~應該算是最直觀基礎的方法了 06/06 01:16
→ joseph103331:通常我們只有在這種做不出來的情形下才會考慮別的... 06/06 01:17
※ 引述《mkmai0802 (Wengda)》之銘言：
: 教授不給我買kit T.T
: 只好拿實驗室有的東西來Try Try 看 ~
: Polymerase 方面的問題 :
: 一般的Taq -
: 會在尾端多加一個A 好像不能用 而且會產生更多突變 !
: NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase -
: 這個可以用嗎 ? 我很怕他會把single-strand primer 切掉 ~
: 我有上它網站查 只有寫說 會產生 Blunt-ended product !
: 也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但沒有寫到會不會把Primer切掉 ~
: Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase -
: 想買這個來用 ~ kit 也用這種的 ~ 具有上述的優點 !!
: 所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿來用 !!
: DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻煩多定序幾顆 ? 是這樣嗎 ?
: 還是大大在做的時候還是會習慣 要加入這個步驟 比較省事 !!??
: Competent cell - 實驗室只有DH5alpa
: DH5alpa 是否也具有將 nicks 修補的功能 !!
: 煩請熟練的大大分享一下心得 ~
: 感謝 !!
其實 我都沒有用kit做的
用的都是一般的PCR方式 只要幾條primer就好了
舉例來說
------GGCCAATtTAAGCTT------ 中間t要換成c
只需要合兩條primer 分別是
5'GGCCAATcTAAGCTT3'
------GGCCAATtTAAGCTT------
3'CCGGTTAgATTCGAA5'
再分別與外面的primer做PCR
=======c==============================primerR
primerF=================g=======
這時候 跑膠回收之後 再分別以這PCR product作為primer和template
進行5-10 cycle PCR之後 再加入外面的primerF和primerR進行一般的PCR即可
通常我的primerF和primerR都是Vector上的
當然 如果有適合的cutting site 只需要一條primer就足夠
同樣以上面為例子
------GGCCAATtTAAGCTT------
在預置換的nt附近剛好有一個HindIII cutting site
這時候只需要合一條primer PCR之後用HindIII切即可
=========================總結分隔線==========================
這方法成功與否 一般取決於primer的設計
如果只是要置換1-2個nt 一般的primer長度就夠了
如果要換多個nt primer的長度要增長
而且PCR跑膠回收之後要進行下次PCR時
我都會先定量 使其molar ratio大概1:1
根據我的經驗會大大提高合併起來的成功率
希望對您有幫助
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