[求救] RNA pellet的回溶

[tempsperdu (valine)]

連續三次RNA濃度都過低(0.1 ug/ul以下)，完全無法轉DNA

以下是我的操作步驟，請大家看看是否有問題，謝謝



1.細胞數量：12 well，50000 cells/well，長7天　（之前也是這個細胞數，抽得出來）

2.TRIzol 400 ul/well，傾斜刮細胞，在顯微鏡下確認細胞已被刮除

3.收集至eppendorf，加chloroform 80 ul，混合均勻靜置2分鐘，12000xg離心15分鐘

4.取上清液170 ul，加isopropanol 200 ul，混合均勻靜置10分鐘，12000xg離心10分鐘

5.倒去上清液，看得到pellet，加75% EtOH in DEPC H2O 1 ml，7500 xg離心5分鐘

6.倒去上清液，看得到pellet，倒置於laminar flow烘乾，確認pellet在管底沒漂走
  (自從第一次做RNA extraction發現有有機溶劑汙染後，我都烘乾1 h，確保EtOH沒殘留)

7.看得到管底有一圈，pellet本身變透明，加15 ul DEPC H2O，靜置5分鐘

8.緩慢pipet 5下，spin down，靜置5分鐘，取2 ul以Nano Vue測濃度



曾想過是否是pellet太乾無法回溶，雖然之前我也是烘乾1 h，
拿三天前也是濃度太低的RNA做測試（保存在-70度。三天總該回溶了吧？），
結果濃度和三天前差不多T^T

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.200
推 shenhsu:一小時太久了吧 囧 可以用tip吸乾放個10-15分就差不多了
→ shenhsu:不然也可以稍微加熱一下 應該是乾到溶不掉了...
→ ashiniii:應該不太可能乾到溶不掉,有時候忙都放好幾天才回溶
→ ashiniii:也是OK的
→ Ianthegood:RNA乾太久好像會無法回溶耶
推 qqmango:加熱55-60 10min回溶
推 huuban:所以之前有成功過囉？做法上有什麼改變？
推 ckr:加熱回溶試試看
加熱回溶會不會破壞RNA呢? 因為我連vortex都害怕會讓它斷掉

→ huuban:qqmango:加熱55-60 10min回溶，我也都是這麼溶的:)
→ huuban:啊不對，我是用65度 xD
推 joseph103331:單純加熱跟vortex應該不會斷掉啦
推 ckr:Trizol的protocol就有55-60度回溶步驟啊  尤其乾一小時應該
→ ckr:不好溶  有機溶劑對你後續實驗影響大嗎?
據說Q-PCR machine會自動終止（雖然我沒經歷過）

→ huuban:不然去借抽氣機？通常都蠻快就可以抽乾了喔~
→ huuban:之前回收量最高可以到多少呢?
只要有0.1 ug/ul以上就可以轉cDNA了，最高有0.2 ug/ul左右吧

→ Realthugz:我記得trizol protocol都有叫你不要晾乾到透明了
→ WinnieDad:RNA vortex不太會斷，畢竟不像是genomic DNA那種大分子
→ puec2:1小時太久 基本上變透明就算是沒救了 DNA RNA都一樣
→ puec2:一點點酒精殘留也不會怎樣
→ puec2:你可以把EtOH倒掉以後 spin 5sec  再用tip把剩下的EtOH吸掉
→ puec2:風乾1分鐘
好，我會試試，謝謝大家
※ 編輯: tempsperdu      來自: 60.251.101.158       (06/23 12:49)
推 ko363630:RNA extraction 沒有加熱的步驟?