[求救] 建立EGFR overexpression stable clone

[koala11234 (wei)]

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那麼我就開始了 事情是這樣的 我最近想利用口腔癌細胞株 OECM-1

將其利用transfection(lipofectamine)的方式 送入一個EGFR-pcDNA3.1的質體

送入後用G418(500ug/ml)挑單一colony 養大後之後用G418 keep著

篩了幾代後 發現細胞篩出來的細胞株 有total-EGFR protein表現比較多但上升不明顯

但是downstream signal 卻是很強(p-Akt,p-Erk) 都是western看到的結果

此外細胞型態也有改變 長的很像之前單純用parental OECM-1 treat EGF 的樣子

感覺有一點EMT 細胞變得有點皺皺老老的 型態很像是好事 但問題來了...

想請問板上的人有無做EGFR過度表達clone的經驗

為什麼我的total-EGFR都沒有變很強 但是下游訊號卻實有上升

我目前是將他keep在10%FBS RPMI media

接下來想試試看若是keep在 low serum 條件下有沒有辦法讓total-EGFR看起來多一點

想請問強者的經驗 或是各路英雄的指點 讓小弟實驗能繼續下去

謝謝大家













發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

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◆ From: 120.126.65.111
推 icome:正常 我之前做ErbB-2也是這樣
→ koala11234:真假?所以total-EGFR沒有多很多 這樣將來可以acept?
→ koala11234:謝謝ｉ大　但是這樣我接下來要怎跟老闆解釋啊？ＸＤ
推 icome:你可以去查以前的文獻 應該很多人做過
→ icome:我想是因為這類RTK細胞有嚴格turnover機制讓它不會累積太多
→ icome:不過因為訊號仍會增強非常多 已經可以達到目的了
→ koala11234:好的 謝謝你有建設性的回答 :)
推 AlertMan:想請問你有看過磷酸化EGFR的蛋白表現量嗎?
→ koala11234:有耶 只是我們家p-EGFR太古老了 有打算買新的跑跑看:)
→ koala11234:之前跑都糊糊的 格下有無高見可以交流交流呢X目
→ koala11234:後來有發現說可以試試看加MG132 I大覺得可行嗎?
推 icome:proteosome inhibitor? 對細胞影響蠻大的 不好吧
推 momyourb:要不試試flow看cell surface 的EGFR
→ momyourb:signaling的放大方式也是一解