[求救] transfer 糊掉

[spirithorse (咩)]

traget protien: 10~15KDa (in 12% sds gel)
transfer condition: 0.22 um PVDF, 400mA 1hr
因為一直都壓不到我的protein, 下圖是將PVDF染Ponceau S後的結果

http://ppt.cc/~mDh
http://ppt.cc/StAV

上片段較大size整個飄移,不知是不是濾紙加的不夠多
or 實驗室有人說是下層膠沒做好或是上層膠的柵欄歪了(我有確定柵欄OK)
下方比較嚴重的是明顯15KDa後什麼都不見了~

麻煩請大家幫我想想問題大概在哪裡,已經test好多次了都是一樣的結果

感謝QQ

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
※ 編輯: spirithorse     來自: 211.76.175.170       (06/21 17:38)
推 qqmango:transfer電流太強了，低分子量的蛋白穿透PVDF跳海了
→ spirithorse:謝謝,請問有比較推薦的transfer條件嗎?
→ blence:感覺上transfer之前就出問題了,gel跑完上面的一切都ok嗎？
※ 編輯: spirithorse     來自: 114.35.0.61          (06/21 23:07)
→ spirithorse:sorry我transfer後沒染膠,但是過程中看front dye正常
→ aeeaee1128:應該是過熱,導致糊掉..是濕式還是半乾式??
推 mesenchymal:但我覺得marker也有點怪, 跑膠也有問題的樣子
推 aeeaee1128:若是半乾式400mA,1小時已經跳海,膜下的濾紙應該有MARK
→ aeeaee1128:的痕跡...給完整的流程,才能一一解答...
→ jabari:這個可以入選殿堂了@_@" 換濕式的轉看看? buffer??
→ jabari:召喚: http://ppt.cc/qe_Q 建議染一片膠看看跑得如何吧
推 crazybrian:SDS-PAGE running buffer check 一下正確否?
抱歉我沒講清楚,transfer是用溼式 400mA 1hr
※ 編輯: spirithorse     來自: 211.76.175.170       (06/22 11:23)
→ aeeaee1128:濕式裡頭放冰雹,外頭用冰加水,300mA 1hr 試看看
→ aeeaee1128:或條件不變,PVDF膜疊二張,二張都染看看,4OOmA沒放冰
→ aeeaee1128:很容易過熱,雖然我是菜鳥研究助理,但western有6年經驗
→ blence:樓上的經驗在原po前文的推文都出現過，應該很難重蹈吧
→ blence:原po先前文的圖每個lane平整,對照下gel的問題才該先解決