[求救] 大分子SDS-PAGE & transfer 條件

[qacvb (朝氣)]

最近正在做 ATM(350kd) Western blot,由於是新手

最近試了幾次, 以5% resolving gel跑 60V,30min + 100V, 90min,

transfer完之後, 今天看結果, 發現根本沒有東西= =+

想請教有經驗的大家, 像ATM這種大蛋白

1.跑SDS-PAGE 該用多少% 的resolving gel? 以及電壓和時間的控制是多少為宜?
  系統是 Mini-PROTEAN®Tetra Cell http://0rz.tw/8XCrB 厚度1.5mm

2.至於transfer的電壓/電流條件和時間約多少較適當?需要O/N嗎?
  磷酸化的ATM 除了lysis時要另加 phosphatase inhibitor外還有其他要注意的嗎?
  使用的是全濕式 Mini Trans-Blot®Cell http://0rz.tw/dVnGj

  先謝謝大家的不吝指教, 感激不盡~^^

PS:補上抗體資訊

ATM: http://www.cellsignal.com/products/2873.html

p-ATM: http://www.cellsignal.com/products/4526.html

麻煩大家了 感激不盡 Orz
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.32.245.199
→ blence:你的transfer時間多久? 這麼高的位置無法用marker當對照喔
→ qacvb:400mA,2.5h,選用的marker是到315kd
→ blence:大蛋白放O/N是比較好,不過這樣的條件應該也可以看到,確認你
→ blence:的Ab是否好用,至於pS1981則需要postive con比較知道問題
推 owl628:你要不要把你實驗詳細過程寄站內信給我,我還滿常跑ATM的WB
※ 編輯: qacvb           來自: 114.32.245.199       (07/06 01:44)