[求救] 我的PCR primer 是不是有問題

[jkq (玩具)]

目前為了找出白蝦裡的血藍素
採了組織  抽了RNA  翻了cDNA
但到了我們要利用設計好的primer 去夾
卻始終夾不出來  連用梯度去跑  也沒東西
想請問看看 是我們的primer有問題 還是哪裡出了問題

這是白蝦的血藍素序列     cDNA 濃度則是4.9 ug/ul
http://ppt.cc/tvMU

而我們設計了兩組primer 加上切位 CCCGGG和CTGCAG

F-5'-AT CCC GGG  G AAATGGGAATTTTCAGAATG-3'
R-5'-AT CTG CAG  TGCATATGTTCTTTATTGTGG -3

F-5'-AT CCC GGG C ATGAAATGGGAATTTTCAGA -3
R-5'-AT CTG CAG AAACAATTCATTCATCGACA -3

配法
cDNA                1
PCR buffer          1
2.5 mM dNTP         1
1/5x 稀釋 Primers   0.2
Taq DNA polymerase  0.1
ddH_2O              6.7
total               10


這是我們的梯度PCR program

Stage1       Stage2(35cycles)              Stage3
95℃     94℃    55~65℃    72℃         72℃     4℃
5min    30 sec   1 min       2 min       10 min   Hold


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.59.89.34
※ 編輯: jkq             來自: 210.59.89.34         (07/18 09:36)
※ 編輯: jkq             來自: 210.59.89.34         (07/18 09:44)
→ skybreeze:要不要先找一組一定夾得出東西的primer看看sample有無
→ skybreeze:問題
推 sunnyforever:可能cDNA濃度太高吧 再稀釋看看
→ jihyang:我拿你的序列去比對 怎麼都沒對應到? 可以說一下 從哪裡
→ jihyang:開始嗎?
→ jihyang:另一方面，RNA抽出來的品質 還ok嗎?
→ jkq:序列不是從CDS開始 而是從在前面一點的mRNA序列開始
→ jkq:因為試過直接從序列開始和結束處 直接設計 但GC值會太高
→ jkq:另外切位後面多加的C或G  只是為了上他接上vector的時候
→ jkq:能呈現三字組
→ Ianthegood:cDNA先稀釋個一百倍吧 體積不同有時候結果也會不一樣
→ Ianthegood:然後gradient可以從50開始拉吧
→ blence:看到這個cDNA濃度，應該是RT完之後拿去測的吧...
→ handolu:cDNA濃度要再稀釋個10倍吧，序列找不到+1
→ jkq:請問pcr濃度多少才適合呢
→ jkq:序列為AAATGGGAATTTTCAGAATG
→ jkq:切位後 就是序列 但不是設計在血藍素本身
→ RickyKckao:一般50uL的PCR我都取1~2ug的template來P