作者sylvialalala (sylvia)
看板Biotech
標題[求救] 有人用recomobination方法clone的嗎
時間Thu Jul 19 22:29:31 2012
要做一個clone一直出不來（insert中間有ccdb sequence，兩端序列相像）
試過傳統方法，也有blunt end，但一直求不到
後來試了recombination的kit (genescript的clonEZ以及neb的gibson)
之前試其他的clone有成功過，但這次怎麼樣都出不來
方法是在vector先切成linear，再用兩端有vector序列的insert去recombine
我的vector是雙切後做gel purify
insert pcr後有做gel purify
再根據kit做，但還是出不來阿～～～～～～～（這個clone我做了三個月阿～～～～）
想請問有用過此方法的高手有什麼該注意的地方
還有recombine的地方離切位多遠就會失敗？
感恩～～～～！！！！！！！！！
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◆ From: 118.166.193.9
推 johanjohan:有ccdB的話，competent cell是關鍵。 07/19 22:50
→ johanjohan:這類的kit也有Vivantis的Flex-C可以選擇~ 07/19 22:51
→ sylvialalala:compent cell我是用invitrogen的ccdb t1～所以應該沒 07/19 23:30
→ sylvialalala:問題～ 07/19 23:30
→ puec2:用yeast 07/20 23:08
→ puec2:E. coli recombination其實不是很穩 07/20 23:09
→ puec2:然後 你弄的應該不是一般sequence吧?AT rich, repeated seq? 07/20 23:10