[求救] Real-time PCR undetermine???

[koala11234 (wei)]

各位板友們好 小弟前來請教關於Q-PCR的問題 還請有經驗的高手們不吝指教

使用的是ABI的系統 看的是一般的mRNA不是miRNA

我想看的一個上皮細胞分化基因Involucrin 使用的internal control為GAPDH

研究對象為口腔上皮細胞 OECM-1 FADU SAS此三株細胞 後兩株較為惡性

第一株為較為良性的口腔上皮癌細胞 因此其分化Marker(Involucrin)的表現量

相較另二組癌細胞高 然而奇怪的是 當我同時拿三株細胞cDNA跑Q-PCR時

後面兩株較為惡性的細胞皆能收到Ct值 然而第一株OECM1卻總是undetermine

曾經跑出過一次有接收到ct值的DATA 確是在第4個cycle就收到 且以上的每次實驗

GAPDH均在20cycle上下 我們這邊實驗習慣並沒有再轉cDNA前定量RNA的量

單純收六公分的細胞培養盤約七八分滿後 將RNA用 40ul 回溶後 取3ul轉cDNA

想問板上使否有高手可以給小弟些意見 目前想到的嘗試方案:

1.減低probe的量(推測是此細胞株此分化基因實在太高)

2.增高cDNA的量(毫無思考的嚐試看看)

3.稀釋cDNA去跑跑看(也是認為是此基因表現太高 不過這樣做GAPDH的cycle數

  想必也會變到很後面)

還請各位高手给小弟弟提點提點 也祝各位大俠實驗順利
















發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 120.126.57.76
推 ckr:how about the dissociation curve?
推 preprice:1.5ml
→ a90648:第四個cycle就有訊號表示量很多，你可以稀釋後再跑跑看
→ koala11234:taqman有再看dissociation curve嗎? p大那是什麼意思呢
→ RickyKckao:taqman沒得看dissociation curve  SYBR green系統才有
→ RickyKckao:OECM的分化基因跑完qPCR之後的curve是像一般的S型嗎?
→ koala11234:沒耶它就是一直抖抖的　沒有到閾值所以undetermine
推 kingtiger:是否跑個膠確認RNA是否有抽到並確定其quality?
→ koala11234:GAPDH18個cycle就P出來了 應該品質還可以吧ˊ_>aˋ
推 qiet:有variant或mutation？