[求救]bisulfite Genomic PCR疑問

[monicatsen (monicatsen)]

想請問有在做DNA bisulfite PCR的各位
我目前的實驗構想
是想去看在表現我目標基因的細胞
在一些stemness上甲基化程度是否受到影響

所以我的實驗流程如下:
bisulfite sequence
1.抽control及表現我目標基因細胞的gnomic DNA
2.ZYMO DNA methylation kit
  去modified gnomic DNA
  (500ng,是protocol建議的量)
3.ZYMO產物
  用吸光值推算濃度,取100ng量跑PCR(用Hot star的DNA polymerase)
4.PCR product直接送定序
  (因為還不知道會被甲基化的位置，所以想先用這種方式粗略的先分析)

但我目前的問題是:
1.PCR沒產物
  這裡用的PCR primer
  primer的序列沒有CG所以只需考慮C-->T的規則
  Tm分別為=48&55 (可以想到可能是兩個溫度差的太大了一點)

2.ZYMO KIT處理完後,其實產物的濃度不高,
  一次的產物大概只能夠我做一次PCR,
  所以要跑gradient PCR對我而言有點為難阿，
  所以想問大家做後面PCR分析會用多少的DNA?

想問大家的看法及建議,謝謝!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 120.126.52.35
推 datro:100 ng biDNA太高 converting過後 吸光值很不準 通常我是當
→ datro:當成100%轉換 稀釋後取10~20 ng的量去跑PCR
→ datro:然後 PCR product直接定序 傳統定序訊號可能會很亂
→ datro:通常不是接TA 定clone 就是用pyro-sequence的方式做會比較好
推 dingoxp:之前也有過PCR沒產物 並且BS處理完濃度更低
→ dingoxp:後來換個Taq與buffer就可以了 主要是因產物有二級結構
→ travelmat:我是跑出來smear，沒專一性BAND ㄒ_ㄒ