[求救] 14kDa的蛋白一直壓不到

[nk12914 (等待)]

我要看的蛋白大小約14kDa,但不知道為啥就是一直壓不到 (抗體確定ok)

試了好多方法，也換過membrane材質，就是一直壓不出來 (連一點背景都沒有!完全空白!)

所以想上來請教大家，請大家能給我一些意見!!拜託~

我的transfer buffer配方

25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 20% methanol

沒有調pH值，配完直接用



semi-dry跟濕式兩種都試過

濕式 400mA或300mA, 一小時

semi-dry 0.8mA/cm2, 一小時或15V, 45分鐘 (這條件是爬文過參考其他板友的建議)

membrane無論是NC還是PVDF也都試過 (兩種用的都是0.22的)

以上條件通通壓不出來 (崩潰 T.T)



我曾試著把sample拿給我同學，請他幫我做WB (抗體也是我給他的)

結果他用濕式400mA, 一小時 竟然可以壓出來!!!!! (徹底崩潰~~)

我跟他只差二抗不同，transfer buffer配方也是一模一樣

後來我還跟他要了一點二抗 (因為想說會不會是我的二抗壞了)

其他條件完全照他的，結果還是一樣崩潰!!!!!!!!!

大概壓了不下十次以上了吧~始終找不到optimal的條件

真的不知道是哪裡出了問題



想請問大家，無論是濕式或是semi-dry，我用的條件是OK的嗎?

可是其他人都能壓到<20kDa的，為什麼我都壓不到 T.T

抗體出問題? 可是請我同學幫忙，結果也OK

本身細胞表現量不高? 可是我上q-PCR，Ct值幾乎跟GAPDH一樣

實在想不出來還有什麼地方有問題了

還是要再提高methanol的濃度呢?



可以請有經驗的大家救救我吧~那是我的target protein，一直壓不出來真是生不如死阿~

麻煩大家了 (鞠躬~)

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.24.70.217
推 alaric:你確定proteins transfer 到membrane了?
→ alaric:懷疑, 您是不是把電接反了?
→ alaric:先檢查SDS-PAGE是否跑好, 再檢查是否轉過去membrane?
回alaric大，我可以很確定電極沒有接反耶，因為同一片membrane，GAPDH都壓得出來
SDS-PAGE跑的時候看起來也沒什麼異狀，所以應該不是電極接反的問題

推 martyrtitan:SDS-free  Meth提高到30%試試
謝謝martyrtitan大的建議，我再試試看~


→ im9527tw:幾%的SDS-PAGE?
10%跟12%的SDS-PAGE都試過了

推 robinduck:q-pcr是RNA的表現，時間點應該比protein早不少
→ robinduck:另外transfer完拿膠去染coomassie blue看有沒有你的band
我也有染過coomassie blue了，如果是semi-dry, 55kDa以下的幾乎都不在gel上了
這樣的話應該也代表我的蛋白也跟著過去membrane了吧?

→ blence:不要再改條件了,直接去同學的實驗室跟著做一遍比較實在
推 wadeedaw:也許根本不是轉的問題 這種半乾條件一定都會過去阿
恩~理論上來說確實這樣的條件應該都會過去，但我想說是不是已經過頭了~
因為壓出來的片子是清清如水，連一點背景都沒有
※ 編輯: nk12914         來自: 114.24.70.217        (08/26 10:09)
推 martyrtitan:墊兩層就知道啦
回m大，其實也試過墊兩層，marker 11kDa確實會跑到第二張mambrane，但還是壓不到蛋白

推 icome:你有染ponceau S確認嗎...
有耶，blocking前都會先染，確實在26kDa以下的部分比較染不太到
※ 編輯: nk12914         來自: 114.24.72.212        (08/26 16:00)
→ aeeaee1128:膜改用GE這牌,transfer時間縮半(有過即可,不用全過)
→ solomo:底片空白?顯影劑失效?呈色劑失效?
推 joseph103331:跟著做一次比較保險 直接用眼睛看比較準
→ joseph103331:很多的細部差異用口述很難告知
推 spirithorse:淚推...我懂版大的苦!!!
→ Anvec:實驗做不出來 有很多很多因素 有時候是不被發覺的地方
→ Anvec:比如電源供應器的穩定性 建議你直接去你同學的實驗室做一次
→ Anvec:排除是操作問題後 再一個一個試 比如借 buffer 借器材
→ Anvec:pH 值有時候也會影響 如果 pH meter 不準的話
→ formosana:我之前也有壓過14KD的,不要跑太久速度要調慢,不然會跳海
→ formosana:不建議用Semi-dry 常常都轉不過去
→ formosana:濕式我有時候會讓他overnight或4小時以上喔!!!
→ nk12914:那可以請問福爾摩沙大~你的transfer條件是多少? 謝謝~
推 alaric:考慮提高SDS-PAGE濃度至18%, 或是確定CBR後可以看到你要的
→ alaric:基本是每條bands 14kD附近, 最好要清晰可分辨.
→ anniepyng:semi-dry不適合transfer小分子蛋白，用濕式比較適合
推 formosana:400mA 20V 害怕過頭就加兩張membrane
→ formosana:之前有別的實驗室都壓不出來,結果是沒有用二次水配
推 windyflyer:我也有差不多的痛..可是我連GAPDH都爆炸了 囧