[求救] PCR P不出來

[kikixie (跟著我走你會迷路)]

我設計了一組 primer 並利用 Biomix 找到 Tm =56.6度 (基因size:787bp)
條件如下:
95度10min-->95度30s,56.6度1min,72度1min(40cycle)-->72度10min-->4度
結果...利用相同條件，只換 enzyme !!!
換成 High fidelity 就 P 不出來 >"<
原本想說可能是 high fidelity 有proof reading 的能力，需要 elongation 時間較長
所以我 elongation 的時間調成 10 min 結果也 P 不出來，學長說可能是 Tm 值太高，
所以我也試著改變 Tm 值 (改成53度) 還是一樣...跑完膠好乾淨 QQ
想請問各位有遇過這種事嗎?該怎麼解決??

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生命跟人惡作劇
  他騙人化進故事理去活
     他用種種的情節引誘著人熱烈的投入
       人 先被故事捉進去了
          然後 那個手麥田的稻草人
            就上當又上當的講了又講

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 163.25.92.152
→ RickyKckao:你要P的序列是GC rich嗎? 可能你換的enzyme的buffer沒
→ RickyKckao:辦法解高GC
→ RickyKckao:比比看兩個enzyme跟buffer的差異 說不定有蛛絲馬跡@@
推 crazybrian:High fidelity對於sample DNA濃度有差! 濃度不能太高
推 huuban:Tm56蠻低的，看你template是什麼吧
→ huuban:不同酵素要參考protocol，說不定它適合hot start?
→ huuban:也說不定它適合更高的Tm值，我們用的習慣都是58-60度
推 Realthugz:都設計在60度附近+1
推 lyu0001:tm 可以到66度都還ok 只要Primer夠長
推 lyu0001:加長primer應該比較有幫助
→ Ianthegood:primer影響最大 新primer我都先拉gradient 50-65
→ kikixie:謝謝大家我再試試看><
推 DJHINN:95 度 10 min @"@?  是哪一家的啊  我 hot start 都 5 min
→ DJHINN:而已， 10 min 酵素還OK嗎  XDD
→ WinnieDad:我的hot start也是需要10分鐘，並非不常見吧。一輪30幾
→ WinnieDad:cycles的PCR跑下來，少說也需要兩個小時，Taq衰退也是比
→ WinnieDad:較後期的事。一開始95度C多五分鐘有差嗎？畢竟每個廠牌
→ WinnieDad:的hot start polymerase製程不同，依原廠說明時間即可。