[求救] miRNA的篩選

[otneiv (oleic)]

想請問一下 要如何在萃取出的眾多RNA中 找到自己想要的miRNA?

另外就是 miRNA的長度並沒有很長 在做RT 以及PCR的時候 PRIMER是如何黏貼上去的?
(有查到兩個方法 一個是利用Oligo(T)特異序列的PRIMER
                另一個是 利用looped Primer
 可是如何能確定做出來的東西是我們想要的  難道不會隨便亂黏嗎?)


最後一個是  SAMPLE裡面的 normalization 是指?



小弟剛進實驗室 然後老闆就丟了個miRNA相關的東西給我
希望我能弄出個大概的實驗流程
(而且實驗室之前也沒有人做過RNA相關  所以也沒有學長姐可以問 Orz)

看了PAPER之後  目前預計的流程應該是:

自SAMPLE萃取RNA  (KIT有分 取TOTAL RNA或者是取small RNA 屆時應該是用後者)
       ↓
   反轉成cDNA
       ↓
real-time PCR
       ↓
   計算Ct值


謝謝指教

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.71.2.84
推 RickyKckao:通常你要先有一個你想看的gene, 再以prediction軟體去
→ RickyKckao:預測有哪些miRNA可能target你的gene
→ RickyKckao:normalization就是平常說的"標準化"在這裡是指用snoRNA
→ RickyKckao:或其他在細胞中表現stable的small RNA作為control
→ RickyKckao:我RT用的方法都是looped primer你可以參考TaqMan miRNA
→ RickyKckao:assay中RT的介紹
推 RickyKckao:prediction軟體在網路上很多, 像是TargetScan, microRN
→ RickyKckao:A.org, PicTar.. 等
→ RickyKckao:如果sample少的話建議用Ambion的Cell-to-Ct kit來抽RNA
→ RickyKckao:從cell lysis到翻RT不像一般需要沉澱或wash, 所以不用
→ RickyKckao:擔心會有RNA lose
→ RickyKckao:做miRNA所要用的reagent都比較貴, 建議先評估值不值得
→ RickyKckao:砸這筆錢下去!
推 huuban:先說明你的樣本，不同物種處理方法差很多
→ huuban:建議你直接跟幾個大廠產品專員去討論
→ huuban:畢竟很多miRNA相關的實驗跟一般實驗用的東西名稱很像
→ otneiv:SAMPLE 預計是用唾液以及血液
→ RickyKckao:是要看secreted miRNA?
→ otneiv:是想看有沒有特異性的miRNA 能代表特定體液
→ RickyKckao:或許要做miRNA array..
※ 編輯: otneiv          來自: 203.71.2.84          (09/03 16:20)
→ otneiv:這樣的話 應該要請廠商幫忙? (實驗是好像沒有相關儀器)
→ otneiv:而且價格應該不斐 = =a  (老闆應該會希望有比較便宜的方法)
→ RickyKckao:我之前問過TaqMan miRNA array 四個sample要價八萬
→ RickyKckao:多問幾間有在做miRNA array的廠商看看吧!
→ otneiv:感謝幫忙!! 我再跟老闆討論看看好了~~
推 HEK293:榮陽也有做Taqman miRNA array，價格差不多就是了Orz
→ HEK293:也可以試試mirDIP先做幾個db的比較，做起來比較有信心
→ HEK293:其實幾個db的預測結果出入也不小，尤其是PicTar很特立獨行
→ windincloud:我想應該是萃取sRNA後跑NGS之類的定序 然後走
→ windincloud:deep sequencing 然後再篩出可能的miRNA
→ windincloud:通常還會搭你想要看的array去分析patten
推 huuban:找已知的用array，有商品化的很好用
→ huuban:找未知，解NGS，無論哪種就先學抽RNA，QC過才能往下做