Re: [求救]bisulfite Genomic PCR疑問

[travelmat (草蓆)]

其實我也有同樣問題...

我之前也是有TRY到一個比較好的條件

僅管做出來一樣是smear一片，但相對明顯有一條專一性的band(size是我要的)

本來預期是以為這樣的condition是非常OK的

於是接下來的sample嘗試以同樣condition下去跑

卻發現不同sample間無法重覆

而即使回到一開始的同樣sample也無法repeat


問過別家有在做類似實驗的，學長給我回應是

1.我sampleDNA是GENOMIC，genomic pcr本來就很麻煩又複雜

2.每次的BISULFITE處理後都視為不同的sample，也就是每次都可能會有不同的condition

3.primer suck


所以就......


而我問我們老師，我們老師給的答案是

PCR就是一項amprify的技術，所以如果你這次primer能bind到正確的位置

那麼他理論上就是會放大，bind的相對多，專一性片段就相對亮

而bind的沒相對多，於是就一片smear

簡單來講，以我的情況就是要看運氣，這次運氣好就有專一性這樣。


我個人做法是把primer anealing的時間拉長，我的想法是

這樣讓primer有比較多的機率去bind到正確的片段(當然非專一性的也可能提高)

後來用這樣做法的確是相對成功率比較高....

不過整體來講還是成功率非常之低.......


目前是改成將PCR進TA，然後考慮用colony hybridization去抓哪個colony有我要的片段


(我好想畢業阿.....)




以上希望對你有幫助....

如果你有進展也請分享給我和大家.....感謝你....

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
→ scherzoinb:我會覺得應該是primer沒有設計好耶~~~
→ scherzoinb:因為bis的treatment...會牽扯到sample中含有C甲基化
→ scherzoinb:多少而定...m跟u的primer上設計的差異點就很重要了
這部份有考慮過

但因為實在找不到其他PRIMER設計位置了

所以只好繼續用這組


→ scherzoinb:我也在想你BISULFITE的kit是不是有問題...
→ scherzoinb:以前我用gDNA經bis處理過後的sample能冰在-20冰箱很久
→ scherzoinb:都還是P的出來...我記得以前我有買過control...
其實我不是用KIT  ㄒ_ㄒ

應該不是 gDNA 壞掉的問題

因為其實還是能P ， 偶爾也會有專一性片段出現(但不是我要的)

只是無法REPEAT之前的DATA而已

推測primer穩定性不夠，也就是專一性不夠之類，所以上面第3點才說 primer suck

→ scherzoinb:某家公司bis處理過的gDNA...當作實驗的對照...
→ scherzoinb:P那個對照就一定會有band..來檢視自己的primer有無問題
→ scherzoinb:拿bis未處理跟處理過的sample去sequencing...會比較準
→ scherzoinb:如果只是檢測用的話...考慮用Q-MSPCR...taqman probe
我自己是有做control，確定這組primer是可以用的 (指可以P出我要的片段)

但因為我做的control相對實驗組環境比較單純，所以只能確定primer可用

其他就無法確定了
※ 編輯: travelmat       來自: 140.120.130.105      (09/07 09:44)