[求救] bacterial colony hybridization

[travelmat (草蓆)]

先簡單敘述一下我的實驗:


1.我有一個 PCR product跑GEL結果是smear，但推測其中有我要的片段

2.我將PCR product做TA clone，送入ECOLI塗plate長colony

3.我嘗試找出帶有某特定片段的colony並將他送定序

(dna序列可推測而得之，但定序前無法100%確定)


目前方向是利用colony hybridization (bacterial)

找的protocol是來自 Molecular Cloning


簡單敘述一下流程

1.利用membrane沾一下plate上的clone

2.利用paper帶有buff黏上membrane進行破菌粹DNA

3.讓DNA binding

4.之後就同southern



我的問題是:

因為以 Molecular Cloning 上的 denaturing solution

中有個東西lab沒有，只有一個功能相近的東西
           |                      |
guanidinium thiocyanate  ， guanidine hydrochloride

確定的是功能都是denature protein，但不確定的是在這份protocol可不可以取代

想請問大家意見。



另外就是

如果改找別份protocol，有版友有做過，推薦哪份protocol嗎?

(目前問了一下，好像都沒人做這實驗.......)

或是有哪些細節需要注意的....



非常感謝各位

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.130.105
※ 編輯: travelmat       來自: 140.120.130.105      (09/06 17:18)
→ RickyKckao:我覺得你可以試試colony PCR~
→ RickyKckao:應該比較簡單@@
感謝

其實我原本就是用colony PCR

但因為PCR product是smear，即使我先gel purify切下我要的片段大小區域

再進TA clone

出來的colony也是有很多不是我要的

colony PCR只能確定insert的片段size而已，無法確定該片段是不是我要的

(因為我要的該段序列我只能"推測"他的序列，再真正定序出來前無法100確定他的序列

所以如果是primer落在insert內部的方法就不可行....)


原本是考慮用colonyPCR看insert size，接著在用enzyme digest再check一次

size都對就送定序做最後確定

但老師覺得這種方法太亂槍打鳥了(或是太花錢?)

於是才叫我做colony hybridization........   ㄒ_ㄒ
※ 編輯: travelmat       來自: 140.120.130.105      (09/07 09:54)
※ 編輯: travelmat       來自: 140.120.130.105      (09/07 09:56)
→ RickyKckao:不過hybridization不就要用insert內部的序列當probe嗎
但那部份是先做出TEMPLATE然後用random primer做出probe

所以實際上我不太需要知道他確切的sequence，而是靠這樣做出probe

這邊是我個人的理解...


還是其實有其他方法我沒想到??
※ 編輯: travelmat       來自: 140.120.130.105      (09/07 14:49)