[求救] ligation求救

[sunptt (風)]

我的insert約2.7kb, vector 5.9kb doule digest overnight

vector use gel clean(因為切兩刀後會掉下約500bp)
ligation 比例 insert:vector=3:1 , 6:1 於室溫下反應45min~1hr
transformation 加10ul ligation solution到complete cell(市售的)
->冰浴 -> heat shock 90sec  -> 冰浴  -> 加LB(不含Amp)培養 ->塗盤

隔天收盤時,每盤約只長不到10顆 而且都不是我要的
有把ligation solution拿去跑膠  看起來都沒有band
感覺是沒有接上去的樣子 =  =


有換過另一個vector 兩個切位就在旁邊酵素切完, clean , CIP
收盤時菌落是比較多了  但看起來都是原本的質體 insert 沒有接上去阿 = =

是因為inssert 片段比較長 所以比較不好接嗎?
想請問  有建議的ligation方法(時間.溫度....)嗎??
我已經前前後做了快半年了(中間有在改東西)  做到都快發瘋了  嗚嗚
感謝大家!!


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.123.126.53
推 conective:1.insert跟vector回收完有測濃度嗎？ 有跑膠嗎？
→ conective:2.ligation可用16度 overnight
推 conective:3.一般一管勝任細胞加1-2μL的DNA就夠了 頂多4μl
→ conective:10μL貌似太多了點 而且你有recover還是長那麼少蠻怪的
→ sunptt:回收完有測濃度,ligation時二者皆>200ng
→ Ianthegood:RE site是什麼?
推 HEK293:1. ligation的比例是重量還是莫耳數？
→ HEK293:2. 請各個步驟都加做positive control，才能troubleshootin
推 leoblack:3:1是指molar ratio,請回算成mole,NEB ligase用16度o/n
→ leoblack:fermentas ligase是22度~不要用錯了
→ travelmat:勝任細胞效率多少? 抗生素確定沒錯? 抗生素濃度多少?
→ blence:"ligation時二者皆>200ng"顯示你們的cloning很多是問題造成
→ blence:可能要找其他lab重新從enzyme digest到ligation檢查問題
→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI
→ sunptt:RE site是XbaI和EcoRI   勝任細胞是買市售的
→ sunptt:抗生素濃度為50ug/ml
→ sunptt:ligation比例是用莫耳數比
→ williamyang:vector會不會XbaI沒切，因為XbaI會切不動dam甲基化的
→ williamyang:序列,有先確認過序列了嗎?
→ blence:在NEB DDF table, 基本型XbaI跟EcoRI不能一起切......