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不好意思打擾大家 在當summer的時候 因為做transfection而有一些步驟上的問題 通常DNA 和lipofetamine 都要先各自加上opti-MEM稀釋過之後 再加在一起,而且lipofectamine protocol上也說lipofectamine就是要先dilute 可是原理是為什麼,或者可能是因為什麼原因影響到實驗結果 我的想法是這樣: 我要做六組不同長度的promoter轉染 所以我就把全部要加的opti-MEM總量600ul 和lipofectamine7.5ul都先加入同一管中 後來在各自trasfer適量到個小管,再分別加入DNA 可是最後因為老師說不行我還是乖乖分開dilute然後再混合 所以也沒有機會映證上述可能會造成的誤差結果 想問問一下板上經驗豐富的各位的意見。 懇請大家幫我解惑 感謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.212.244
RickyKckao:lipo和DNA比例要適當 DNA才比較容易進去lipo 且lipo很 09/25 23:57
RickyKckao:容易附著在塑膠管壁上 所以在dilute的時候要確實加到op 09/25 23:58
RickyKckao:ti-MEM裡面. Protocol裡面也有列出多少DNA用多少lipo的 09/25 23:59
RickyKckao:table 用意就是在最佳化lipo:DNA的比例 不過隨著transf 09/26 00:00
RickyKckao:ection細胞的不同 通常最佳的比例也不同 那就要多試試 09/26 00:01
RickyKckao:嘍~ 另外我以前做也是像你一樣配stock 但並沒有甚麼問 09/26 00:02
RickyKckao:題呀@@ 我覺得只要確實把lipo+opti-MEM和DNA+opti-MEM 09/26 00:03
RickyKckao:分開配 應該是不會有問題 09/26 00:03
Realthugz:沒問題+1 09/26 00:22
dogan:謝謝各位回答,但我的問題是為什麼一定要分開DILUTE我不能 09/26 00:29
dogan:把COMMON的東西加完之後TRANSFER之後在各加入dna嗎 09/26 00:30
RickyKckao:DNA跟lipo分別dilute後再混和 DNA和lipo接觸的比例較均 09/26 00:36
dogan:我曉得LIPO和dna會有一個OPTIMAL的比例是要試的,可是我想現 09/26 00:37
RickyKckao:勻 想想通常要加入的DNA濃度是較高的 雖然加入total溶 09/26 00:37
RickyKckao:液之後就會被稀釋, 但是在加入的那一瞬間 是很濃的DNA 09/26 00:38
RickyKckao:去接觸到lipo 這樣並不有利於DNA進入lipo 09/26 00:39
dogan:恩 有道理 !!謝謝你喔 我會繼續去網路上找相關資料 若有什 09/26 00:41
dogan:麼新的想法和意見麻煩再告訴我 感謝! 09/26 00:41
RickyKckao:也可能造成每個lipo帶的DNA量差異大 有的沒有 有的很多 09/26 00:42
dogan:那請問 LIPOFECTAMINE DILUTE之後室溫下INCUBATE 5MINS 09/26 00:51
dogan:只是為了要讓他SUSPEND均勻而已嗎還是有其他意義? 09/26 00:52
RickyKckao:我也想過這個問題 但除了讓它均勻 我想不出其他理由@@ 09/26 01:00
RickyKckao:商業機密吧 哈哈 09/26 01:00
dogan:@@ 難怪我一直查書查網路都沒有 嗯 今天麻煩你了 THX! 09/26 01:05