[求救] 回收切過的質體

[adamada (soso)]

 小弟我把pUC19用SmaI切4小時

 之後跑膠然後回收!!!

 未切跟切過的pUC19有一起跑膠檢查過大小是不一樣的(1.5 kb vs 2.7 kb)

 但是如果直接拿切過的pUC19作transformation 到E.coli

 結果還是會有大量的菌落..請問這是因為我pUC19沒切好嗎??

 還是細菌自己會做ligation.....

 亦或我要補做CIP??

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◆ From: 134.76.70.252
→ blence:EtBr下看到未切的位置沒訊號不代表沒pUC19,要考慮影像極限
※ 編輯: adamada         來自: 134.76.70.252        (10/05 17:42)
※ 編輯: adamada         來自: 134.76.70.252        (10/05 17:44)
→ adamada:我只有切2.7那邊回收膠所以我不懂blence您的回答??
→ puec2:沒切好 另外enzyme有極限 不應該假設100%都切乾淨
→ puec2:所以有的人會喜歡在常用的plasmid的MCS裡面放一段DNA
→ puec2:這樣用enzyme切的時候 有切乾淨跟沒切乾淨的位置差很遠
→ puec2:用這種方式減少沒有切乾淨的DNA的汙染
→ puec2:然後細菌的確會自己做ligation 不然怎麼做DNA repair
→ adamada:所以要怎樣做才叫有切好??畢竟切過跟未切過的大小差了1kb.
→ blence:不是DNArepair就能end-joining,而且Ecoil的EJ還需要Rec活性
推 aceliang:不管怎樣做，都沒有100%切乾淨的可能，切好否看你的定義
→ aceliang:切過跟沒切過大小也沒有差，那只是circular/linear差別
→ aceliang:你沒看到，不代表膠體內完全不含circular form plasmid
推 alaric:我有一個疑問, pUC19有兩個SmaI切位嗎?
→ adamada:pUC19只有一個SmaI!
推 milkpa:SmaI為blunt end，有看到兩個片段（可能為supercoil）表示
→ milkpa:八成沒切乾淨
推 alaric:酵素切 O/N 吧.
推 hsuwenli:你的pUC19有做過antibiotic的test嗎?你確定colony是pUC19