關於Cloning construct的困難...

[DolphinWendy (小海豚)]

各位大大>  <
想要向各位求助一下
我現在在做cloning，
問題有以下：
1.digest完後gel extraction濃度超低，都不會超過20ng/uL.....
2.學姊說，儘管我切膠萃取濃度只有19.3ng/uL(我回溶40uL)，
  但是vector這樣的濃度已經夠了，然後我的insert是我自己設計的
   primer linker(total只有45bp)。既然學姊說vector夠了，我就直
  接做下去了，做到ligation，做了n次，試了不同比例都無法成功，
  學姊們說，linker的ligation要1:30~1:50....且做ligation時linker
  就當作100bp去做計算。
  我的vector是7.6kb濃度只有19.3ng/uL，linker是45bp(當作100bp計算),
  濃度有320ng/uL(這是做過annealing後的濃度)，如果照學姊們說的比例
  (1:30~1:50)這樣linker量要加超多!!!然後我們實驗室是用ligation high，
  要和sample 1:1混和，這樣ligation的總體積就超多= =
  然後，之後transform加入菌液的體積就要更多，重點是，塗完plate之後，
  overnight每次都是空空如也T^T.....做好幾次都這樣，有沒有人可以提供點意見?

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◆ From: 1.162.7.76
推 joseph103331:首先 你digest的時候用多少vector下去切?
→ joseph103331:再來 重新檢查insert是否有問題(保險起見)
→ joseph103331:然後 那個比例是什麼比例? 是莫耳數比 還是濃度比?
→ joseph103331:最後可以換其他ligase做看看
推 micocat:linker有PNK嗎
推 Realthugz:那vector就拿多一點去切阿... 也花不了你多少時間
推 Dusha:我還曾經濃度低到測不出來 硬著頭皮做 最後有成功喔
→ Realthugz:ligation挑菌做N次不是更浪費時間
推 Realthugz:如果怕gel extraction做不好 試試直接過column或沉澱啦
→ blence:依照你的數字怎麼算都是linker要加超少量,至少要再稀釋10倍
→ DolphinWendy:因為實驗室學姊們都說回收率低，甚至都要下到10~20ul
→ DolphinWendy:學姊們幾乎回收率都很低，所以vector幾乎要下到10~20
→ DolphinWendy:至於比例呢，是用[vector]x7.6x量:[linker]x0.1x量
→ DolphinWendy:照這樣算linker要加超多吧@@
→ DolphinWendy:vector當然可以多切一點....只是我想找出原因...不然
→ DolphinWendy:會越下越多...我之前有在不同實驗室做過cloning，
→ DolphinWendy:vector頂多下個3~5ug就夠了，因為回收率夠高
→ DolphinWendy:不過之前不是自己設計的linker，而是另外一個切下來
→ DolphinWendy:的insert，在這實驗室所設計的linker是很多切位合起
→ DolphinWendy:來的，以利後續的步驟。
→ DolphinWendy:是ligation做n次，根本沒辦法挑菌，因為根本沒長= =
→ DolphinWendy:老闆也叫我直接沉澱直接ligation，但是我覺得不可能.
→ DolphinWendy:因為我digest完不要的那一段有2kb多，可是我要接進去
→ DolphinWendy:的linker只有45bp，這樣直接沉澱ligate太危險了
推 qiet:比例是[vector]x量/7.6:[linker]x量/0.1吧?
推 qiet:照你那樣算當然體積會超大
推 joseph103331:用除的啦 你加這麼多搞不好通通自接去了....
→ blence:vector只要切0.5~1ug就很夠做了,多切只會造成越多切不乾淨
→ blence:濃度20ng/ul很夠了,會做不出來是其他的問題
→ DolphinWendy:ㄜ...為什麼之前的實驗室試教我用乘的呢@@
→ a90648:1.你記錯 2.他們教錯
推 qiet:那個比例是莫耳數比  不要只記算式~
推 Realthugz:insert短 所以量少但是莫耳數高
→ lask:是莫耳數比 所以計算時會出現倒數...但是你要去記意義比較好
→ cyken:你的算法根本錯誤，你的insert稀釋10倍來用都還嫌太濃
→ cyken:回去重念高中化學再來做實驗
→ cyken:        ^國中