[求救] 有人用過中研院的shRNA嗎?

[devilcos (努力賺錢)]

之前有爬過文 大家拿到中研院的shRNA後好像都是直接做

有人是拿到之後將shRNA切下來接到其他的vector嗎?

由於實驗需要 我訂了中研院的shRNA 以後用vector上的NdeI與EcoRI將shRNA切下

size約130bp 但是切下來後看不到130的地方有band shRNA的量我用1ug去切

切了好幾次 頂多只看到200bp的地方有band但是會糊糊的

gel extraction後的濃度只有6ng/ul 有試著ligation與transform 但塗plate後沒長東西

shRNA的序列有先去定序了 確定序列上是有NdeI與EcoRI兩個切位

然後我要接進去的vector大概是8kb

已經切好多次啦但還是不行>"< 不知道有沒有人這樣做過成功的拜託告訴我

另外酵素是用NEB的 都是新的 所以應該沒有放太久壞掉的問題

麻煩大家了Orz




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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.116.61.106
推 silentence:insert size這麼小會很不好接 而且照gel時訊號會很弱
→ silentence:從描述看來應該是insert量不夠的問題
→ blence:pLKO至少7kbp,切1ug頂多拿到60ng,elute更不可能拿到6ng/ul
→ blence:除非你用8ul或更少去elute,而且也濃度跑膠也不可能看到東西
→ blence:如果長度只有130bp,拿plasmid去PCR後直接切與接或許較方便
推 Ianthegood:樓上專業
→ devilcos:好謝謝各位的意見 我會試著用PCR放大的方式去做做看