[求救] protein已定量但actin卻不equal?

[skyofsilver (silversky)]

各位大大好:

近來我在收取Western blot所需的細胞lysate後 以Bio-rad protein assay這組kit進行

定量後發現actin還是不甚equal 仍須用肉眼判定量的多寡來微調

想問一下是不是我實驗的哪個步驟出了問題


我所使用的藥物是會導致細胞死亡的藥物 最高劑量大概可以使整盤p10的細胞死亡60~70%

而我收取lysate的步驟如下:


=> 用細胞刮勺將細胞刮下後 連上液(medium)一同加入離心管中

=> 將細胞離心下來之後 PBS wash一次

=> 細胞pellet加入 HNTG lysis buffer回溶(此步加入protease inhibitor)

=> 冰負80度C 一小時以上或overnight後 放在4度C shaker上搖晃一小時

=> 13000rpm 30分鐘

=> 取上液負20度C保存



定量步驟如下:

使用BCA標準品 0.125, 0.25, 0.5mg/ml 並使用ddH2O當作blank

Sample四倍稀釋 18ul ddH2O + 6ul sample

每一well加入10ul 並加入200ul Bio-rad protein assay 抽吸15次確保mix均勻

使用ELISA reader 570nm測定


在之後的計算中 我每次蛋白質的定量在標準品所畫出來的公式線r平方值都在99以上

但是換算出來後 使用Western去看 發現actin還是不太equal 尤其是加藥高劑量的那一組

想請問是不是在我收lysate的過程中有哪一步驟是錯誤的導致裡面有其他蛋白也跟kit反

應而被定量到了呢?





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◆ From: 218.173.33.127
→ skyofsilver:定量前sample都有vortex並spin down
推 chench0710:我想到幾個可能原因:
→ chench0710:1.藥物會影響定量試劑(甚至是被算進蛋白質濃度?
→ chench0710:2.你的藥物會破壞actin~~!可喜可賀!發篇大的吧!
→ skyofsilver:我之前也有懷疑過~ 不過有壓tubulin 走向跟actin是差
→ skyofsilver:不多的~
→ skyofsilver:如果是藥物的關係 是要增加PBS wash次數嗎?
推 sisley:我也常常遇到藥物treat過後的actin都不準 @@ 目前無解
→ blence:連medium的死細胞也一起收就會這樣,沒必要不需要這樣收
→ blence:還有把離心後的上清液凍在-20是很不好的,怎樣這種protocol
→ raiyu:換別的internal control呢? 我們有些會影響tubulin的藥物 WB
→ raiyu:的internal control是用GAPDH
推 jsi:可做其他種類的internal control看看,不過我猜結果應該是差不
→ jsi:多，加藥實驗常會遇到這種狀況，如果你要呈現蛋白定量一致的WB
→ jsi:圖，可用軟體對band進行相對定量來比較。若想要以相同的actin
→ jsi:band WB圖顯示，那就得在進行第一次WB之後目測或軟體測band，
→ jsi:再微調下次loading量。雖然我覺得這個方法有點爭議，但很多人
→ jsi:是這麼做。幸好一篇paper通常會用數種方法來證明論點，所以我
→ jsi:就還可以接受這爭議的方法。
→ skyofsilver:我們現在是採用j大的方法 另外離心後的上液就是lysate
→ skyofsilver:了阿 應該是凍負20度C沒錯吧?
→ Ice9:零下80度凍一段時間，很多蛋白的量都會改變，你覺得零下20度
→ Ice9:會比較保險嗎？  有些時候，解凍完的蛋白，我們會重新定量。
推 tsubasawolfy:每次wb前都重新定量一次是比較保險 而且要分裝-80
→ skyofsilver:感恩~
推 mesenchymal:基本上原因就是細胞死太多的關係
→ skyofsilver:所以死掉的細胞會有多的蛋白質被定量到囉?