[求救] SNP 限制酶切(CAPS)相關問題

[sunnyshine ( )]

想請問一下大家

目前在做SNP相關的實驗  想利用限制酶的方法來確認是否有SNP

primer設計好了  也放下去PCR了 但是在加了限制酶後去跑膠 pattern變得很霧

我的方法是PCR完後  直接加酵素和buffer  37度作用2小時候跑膠

不知道這邊是不是有什麼其他要注意的地方

還是應該先跑膠elute後再酵素切

希望有經驗的人可以幫忙指點迷津~~

謝謝喔!!!

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◆ From: 140.116.235.106
推 HEK293:你怎麼知道有沒有amplification?? buffer環境也不同阿
→ HEK293:最少也clean up或是EtOH precipitation吧~
→ HEK293:然後膠是跑幾%？產物多大？
→ sunnyshine:是要純化最好沒錯，不知道有沒有簡便的方法呢??因為實
→ sunnyshine:驗室在這邊都沒有相關經驗。膠是做2% 產物是兩百bp
→ sunnyshine:切完大概要往下掉20幾個bp
→ blence:你不是要簡便方法,而是要自己試條件,請先確認PCR完產物狀況
→ blence:產物品質不好,或不是單一band,後續怎麼做? 另外PCR產物直接
→ blence:切RE還要考量產物的salt等對於RE作用的影響或改變RE專一性
→ blence:請先PCR產量最佳化後取極少體積切RE,這樣才能達到要的效果
推 aceliang:我不懂做實驗為什麼要考慮「簡便」，而不是正確性。
→ sunnyshine:有同時做一組control確定產物是沒問題的，單一band,大
→ sunnyshine:小也是對的! 會提到"簡便"是因為後續檢體會很多，想了
→ sunnyshine:解是否在這方面大家是怎麼去克服的或是直接點出我錯誤
→ yaprint:切酵素的buffer環境會造成專一性改變，有些酵素會變成亂切
→ yaprint:NEB酵素的網頁都會有些特別提醒喔！
→ sunnyshine:的作法!謝謝大家喔所以原理上PCR產物不能直接酵素切喔?
→ blence:在目前SNParray或MALDI-TOF等大規模定SNP年代以前,傳統都是
→ blence:直接把PCR產物拿去切RE,沒那麼多時間純化,不過都要花時間試
→ blence:應該說連taqman出來之前都用這樣的PCR-RFLP看SNP的
推 qiet:你取多少PCR product去切? 可能PCR buffer中的鹽離子會影響
→ qiet:到RE的反應  反應的體積也要注意 避免star effect...
→ qiet:PCR產物直接切是OK的
推 HEK293:稀釋倍數要試條件，如果是已經確定pattern，就免純化
→ sunnyshine:PCR出來的總體積是25ul，我取10出來切，體積補到20ul去
→ sunnyshine:酵素反應，剩下10ul當control；昨天試過用純化，的確
→ sunnyshine:band看起來很OK，可是重點...他沒切 囧，跟control比，
→ sunnyshine:不但沒切還往上shift一點，請問是因為鹽離子影響嗎?還
→ sunnyshine:是??? 囧囧囧
推 qiet:RE buffer中鹽離子的關係會影響到跑膠的pattern