[求救] ICC double stain?

[eric2853 (eric)]

各位板友好

我最近在做ICC的實驗

必須要double stain兩種抗體

第一種的抗體host是rabbit

第二種是goat

因此我使用的二抗也有兩種 分別是donkey anti-goat(Cy3)

以及donkey-anti-rabbti(FITC)

我問學長時 他告訴我一抗跟二抗都可以以1:1混合一起加下去

一抗4度C overnight 而二抗室溫一小時

可是我用顯微鏡看的時候 兩個都沒有出現螢光!!!

所以想請問各位

是否一抗跟二抗不可以同時加下去呢??

謝謝各位


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◆ From: 140.112.121.98
→ blence:[猜測] 你應該沒有單染抓好條件
→ eric2853:嗯我還沒單染 明天會來試試看 只是想先問問大家:)
→ yauwin:邏輯上 一二抗不能一起加 抗體先混在一起會產生抗體凝集效
→ yauwin:應 一抗會被二抗凝集 不能好好作用其antigen
→ yauwin:除了特別廠商賣的二抗 才可以先和一抗加一起
→ eric2853:樓上 不好意思 我指的是 先加完double stain的兩個一抗
→ eric2853:作用overnight之後 再加入兩個二抗 並沒有一二抗一起加喔
→ vandia:我的double stain一直都是混加rabbit跟mouse 沒有問題
→ vandia:我覺得問題可能出在一抗跟抗原的那部份太低
→ eric2853:不好意思 是指抗體濃度或是抗原表現太低嗎?
→ blence:問題不是濃度太低或怎樣,而是做ICC本來就要先測試單染一抗
→ blence:或二抗先測試抗體專一性與調整適合螢光強度,才會合併一二抗
→ blence:每個抗原只要經過各別一,二抗測試,就能做你設想的co-stain
→ blence:做ICC沒測試抗體竟得到不能一起染的推測,很缺乏實驗邏輯
→ eric2853:樓上我了解了 謝謝