[求救]小片段DNA(100bp)染內染沒東西

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不好意思  我的載體是pET21a 片段大小約100bp

我利用先前加入的切位(設計時加入)切不到片段

但利用PCR卻p的出來

然後利用其他的內切位 確認

(若有接入為200bp，沒有則只切的下100bp)

切的下200bp的片段

我到底發生什麼事了.....

各位大大謝謝

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◆ From: 140.120.213.240
※ 編輯: oCrazyDucko     來自: 140.120.213.240      (12/10 11:01)
※ 編輯: oCrazyDucko     來自: 140.120.213.240      (12/10 11:01)
推 kaifish:可能只是看不到：1.提高plasmid作用濃度至10ug
→ kaifish:2.跑膠時間不要太久，100v for 5~8 mins就先去照膠
→ oCrazyDucko:我沒去測過濃度 不過我都是養菌O/N 取3cc 用kit抽
請問這樣夠嗎?
※ 編輯: oCrazyDucko     來自: 140.120.213.240      (12/10 11:50)
推 kaifish:pET21a約5.5kb，取1ug去切也只能得到20ng insert
→ kaifish:跑膠可能會看不清楚
→ kaifish:所以可以試試看提高反應的量
→ blence:plasmid夠不夠跟elute體積與拿去切RE的量有關,跟抽幾cc無關
恩   這個我知道 可能是太心急了沒交代清楚 真的很不好意思

我可能養大量一點 測看看濃度吧   那可以請問大概要多少ng or ug 100bp

才能看得清楚呢
※ 編輯: oCrazyDucko     來自: 140.120.213.240      (12/10 14:50)
→ blence:一般lab做agarose染EtBr的靈敏度約10ng,內染的膠跑越久EtBr
→ blence:會越往上,往下跑的band就更弱更難看到,可以從k板友的算法
→ blence:計算若要有目視易見的band,每個well需要切多少plasmid才夠
推 leoblack:EtBr外染比內染來得更靈敏,片段小試著用外染看看